Rekombinant blok biyopolimerlerin üretimi

Bu projede serisin biyopolimerinin blok polimer olarak rekombinant üretimi amaçlanmıştır. Rekombinant üretim için konukçu hücre olarak Pichia pastoris X33 suşu kullanılmıştır. Blok polimer gen dizisi Bombyx mori orta salgı bezinden izole edilmiş toplam RNA kullanılarak sentezlenmiştir. Blok polimerlerin yapısal karakteristiklerinin polimer içerisindeki blokların tekrarlanma sayısına doğrudan bağlı olması nedeniyle moleküler teknikler ile blok dizileri hazırlanmıştır. Hazırlanan diziler 114 ve 1407 baz çifti uzunluğundadır. Bu diziler Pichia pastoris'te yüksek seviyede kontrollü ifade edilmesini sağlayan pPICZalphaA plazmidine klonlanmıştır. Bu plazmitler maya hücresine elektroporasyon yöntemi ile aktarılmıştır. Antibiyotiğe dayalı seçim ile transforme olan maya hücreleri seçilmiş ve aktarılan geni içerip içermedikleri kromozomal DNA izolasyonunun ardından PCR ile tespit edilmiştir. Bu doğrulama işleminden sonra laboratuar ölçeğinde protein ifadesi çalışmaları yapılmıştır. 250 ml'lik erlenlerde 30 ml besiyeri içerisinde metanol indüklemesi ile yapılan üretim sonunda SDS-PAGE analizinde indüklenmiş kültürlerde serisin proteininin 43 kDa büyüklüğündeki kısmının kültür ortamına salındığı tespit edilmiştir. Bu protein metanol ile indüklenen hücrelerin üretim ortamında görülürken metanol indüklenmesi yapılmayan kontrol kültüründe bu proteine raslanmamıştır.