İcariinin vasküler gevşetici etkisinde sfingozin-1-fosfat reseptör 1(S1PR1)’1n rolünün araştırılması

Sfingozin-1-fosfat(S1P), sfingozin kinaz(SK)’ların ürettiği biyoaktif sfingolipit metabolitidir. S1P, vasküler gelişim/stabilite, anjiyogenez ve vasküler tonusun düzenlenmesinde önemlidir ve bu sinyal yola ındaki bozukluklar ateroskleroz, diyabet, hipertansiyon patolojisinde bildirilmektedir. S1P’nin, sfingozin-1-fosfat 1-5 reseptörleri(S1PR1-5) olarak beş farklı reseptörü bulunmaktadır. SK enzimleriyle oluşan S1P; vazodilatasyon ve vasküler geçirgenlik üzerinden etkilerini S1PR1 ve S1PR3’leri aracılığıyla göstermektedir. Düz kas gevşetici, nöroprotektif, kardiyovasküler hastalıklardan koruyucu, antienflamatuvar etkileri olan icariin(İCA); düz kas gevşetici ve antiaterosklerotik etkilerini S1P ile benzer şekilde PI3K/Akt-eNOS-NO yolağının aktivasyonuyla göstermektedir. İCA ile S1PR1/S1PR3 agonistlerinin miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarı ve Parkinson-Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarda inflamasyonla ilişkili ortak etki mekanizmalarını paylaşması nedeniyle "İcariin vasküler gevşetici etkisini S1PR1 ve/veya S1PR3 aracılığıyla gösterebilir mi?" soru ile, ilk kez icariinin aorta üzerindeki gevşetici etkisine S1PR1 ve S1PR3’ün katkısını biyokimyasal/farmakolojik çalışmalarla araştırmayı amaçlamıştır. İCA gevşemelerinin endotele bağlı ve/veya NO aracılı olduğunu kanıtlamak üzere, endoteli sıyrılmış aortalar ve nitrik oksit sentaz inhibitörü L-NAME(100 μM, 30dk.) inkübasyonu varlığında yanıtlar alınmıştır. İCA’nın sfingozin yolağı ile ilişkisi yolak üzerinde yer alan enzim ve reseptör inhibitörleri kullanılarak fonksiyonel çalışmalarla incelenmiştir. İCA’nın seramidaz enzimiyle ilişkisi, seramidaz enzim inhibitörü olan D-erythro-MAPP(MAPP; 3-10 μM, 30dk.), sfingozin kinaz enzimiyle ilişkisi, sfingozin kinaz enzim inhibitörü N,NDimethylsphingosine(DMS; 10-30 μM, 30dk.), S1PR1 ile ilişkisi S1PR1 reseptör antagonisti W146(1-3 μM, 30dk.) ve S1PR3 ile ilişkisi S1PR3 reseptör antagonisti CAY10444(10-30 μM, 30dk.) aracılığıyla araştırılmıştır. İnhibitörler varlığında/yokluğunda aorta dokularından fenilefrin(10-7 M) ile ön kastırma sonrası kümülatif 1CA(3x10−7M -10−4 M) gevşeme yanıtları alınmıştır. İCA’nın EC50 değeri(3 μM); aorta doku kültüründe (24 saat, 37°C, %5 CO2 inkübatörde) inkübasyon konsantrasyonu olarak kullanılmış ve western blot ile SK-1, S1PR1 ve S1PR3 ekspresyon düzeyleri western blotla araştırılmıştır. Nitrik oksit(NO) düzeyleri Griess reaksiyonuyla kit protokülüne uygun şekilde spektrofotometrik ölçülmüştür. Sonuçlarımıza göre, İCA gevşemeleri endotele bağlı/NO aracılıdır. DMS ve W146 varlığında istatistiksel olarak anlamlı şekilde gevşemeler azalırken, MAPP ve CAY10444 varlığında değişmemiştir. SK-1 ve S1PR1 protein ekspresyon düzeyleri artarken, S1PR3 ekspresyondüzeyleri değişmemiştir. İCA, toplam nitrat/nitrit düzeylerini arttırırken, bu artış inhibitörler(W146, DMS, L-NAME) varlığında geri dönmüştür. İCA’nın sıçan aortasında S1P üretiminden sorumlu SK enzimlerinin ve/veya S1PR1 aracılığıyla gevşetici etki oluşturduğu gösterilmiştir. NO ilişkili patolojilerde, NO üretiminden sorumlu sinyal yolaklarının önemi ve tedavide seçilecek ajanın buna göre belirlenmesi önemlidir. Sfingozin sinyal yolağının bozulduğu ve bu yolakla ilişkili NO yetmezliğinde özellikle endotel disfonksiyonuyla ilişkili hipertansiyon ve ateroskleroz gibi vasküler hastalıkların tedavisinde İCA’nın kullanılması yeni ve etkili bir ilaç adayı olma potansiyeli klinik olarak önem taşıyabilir.

Sphingosine-1-phosphate(S1P) is a bioactive sphingolipid metabolite produced by sphingosine kinases(SK). S1P is important in regulating vascular development/stability, angiogenesis and vascular tone, and disorders in this signaling pathway are reported in the pathology of atherosclerosis, diabetes, and hypertension. S1P has five different receptors, called sphingosine-1-phosphate 1-5 receptors(S1PR1-5). S1P is formed by SK enzymes; It shows its effects on vasodilation and vascular permeability through S1PR1 and S1PR3. Icariin(ICA), which has smooth muscle relaxant, neuroprotective, cardiovascular disease protective, and anti-inflammatory effects; shows its smooth muscle relaxant and antiatherosclerotic effects through activation of the PI3K/Akt-eNOS-NO pathway, similar to S1P. Since ICA and S1PR1/S1PR3 agonists share common mechanisms of action related to inflammation such as myocardial ischemia/reperfusion injury and Parkinson-Alzheimer, the question is "Could Icariin exert its vascular relaxant effect through S1PR1 and/or S1PR3?". The question aimed to investigate, for the first time, the contribution of S1PR1 and S1PR3 to the relaxant effect of icariin on the aorta through biochemical/pharmacological studies. To prove that ICA relaxations are endothelium-dependent and/or NO-mediated, responses were obtained in the presence of endothelium-stripped aortas and nitric oxide synthase inhibitor L-NAME(100 μM, 30 min.) incubation. The relationship of ICA with the sphingosine pathway was examined through functional studies using enzyme and receptor inhibitors on the pathway. The relationship of ICA with the ceramidase enzyme, the ceramidase enzyme inhibitor D-erythro-MAPP(MAPP; 3-10 μM, 30 min.), the relationship with the sphingosine kinase enzyme, the sphingosine kinase enzyme inhibitor N,NDimethylsphingosine(DMS; 10-30 μM, 30min.), its relationship with S1PR1 was investigated through the S1PR1 receptor antagonist W146(1-3 μM, 30min.) and its relationship with S1PR3 was investigated through the S1PR3 receptor antagonist CAY10444(10-30 μM, 30min.). Cumulative ICA(3x10−7M -10−4 M) relaxation responses were obtained from aortic tissues after pre-contraction with phenylephrine(10-7 M) in the presence/absence of inhibitors. EC50 value of ICA(3 μM) was used as the incubation concentration in aortic tissue culture (24 hours, 37°C, 5% CO2 incubator), SK-1, S1PR1, and S1PR3 expression levels were investigated by western blot. Nitric oxide(NO) levels were measured spectrophotometrically using the Griess reaction by the kit protocol. According to our results, ICA relaxations are endothelium-dependent/NO-mediated. While relaxations decreased statistically significantly in the presence of DMS and W146, they did not change in the presence of MAPP and CAY10444. While SK-1 and S1PR1 protein expression levels increased, S1PR3 expression levels did not change. While ICA increased total nitrate/nitrite levels, this increase was reversed in the presence of inhibitors (W146, DMS, L-NAME). It has been shown that ICA has a relaxant effect in the rat aorta through the SK enzymes responsible for S1P production and/or S1PR1. In NO-related pathologies, it is important to determine the importance of the signaling pathways responsible for NO production and the agent chosen for treatment accordingly. The use of ICA in the treatment of vascular diseases such as hypertension and atherosclerosis, especially those associated with endothelial dysfunction in cases where the sphingosine signaling pathway is impaired and NO deficiency associated with this pathway, may be of clinical importance as it has the potential to be a new and effective drug candidate.