Isolation, purification and immobilization of UDC-glucuronyl transferace.
| dc.contributor.advisor | Telefoncu, Azmi | |
| dc.contributor.author | Zihnioğlu, Figen | |
| dc.date.accessioned | 2024-08-19T19:32:30Z | |
| dc.date.available | 2024-08-19T19:32:30Z | |
| dc.date.issued | 1992 | |
| dc.department | Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya Ana Bilim Dalı | en_US |
| dc.description | Bu tezin, veri tabanı üzerinden yayınlanma izni bulunmamaktadır. Yayınlanma izni olmayan tezlerin basılı kopyalarına Üniversite kütüphaneniz aracılığıyla (TÜBESS üzerinden) erişebilirsiniz. | en_US |
| dc.description.abstract | ÖZET Ksenobiyotiklerin, organizmadan atılımı, genellikle toksik maddelerin suda çözünebilir metabolite dönüştürülmesini gerktiren bir prosestir. Glukuronidasyon, bu sistemde yer alan ve ksenobiyotiklerin veya endobiyotiklerin suda çözünebilir forma çevrimini sağlıyarak, bu maddelerin idrar ve safra yoluyla atılımını kolaylaştıran bir reaksiyon mekanizmasıdır. Detoksifikasyon sisteminde yer alan enzimatik oksidasyon ve indirgeme reaksiyonlarının fonksiyonları yaygın bir şekilde araştırılmıştır. Kimyasalların gulukuronit konjugatlarına çevriminden sorumlu olan enzimatik prosesler ise son yıllarda ilgi odağı olan bir konudur. Konjugasyon reaksiyonları; iki faz gerektiren bir reaksiyon sistemi olup; oksidasyon (Faz I) reaksiyonlarında madde önce bir hidroksilasyon reaksiyonuna girer ve bunu gulukuronidasyon (Faz II) reaksiyonu takip eder. İlgili olan substratın (toksik madde, ilaç vb.) yapısına bağlı olarak bu mekanizmada farklılıklar gözlenebilir. Birçok ilaçlar ve çervresel kimyasallar (öm;morfin, naftoller ve fenoller) hidroksillenerek organizmadan atılımları sağlanabilir veya aminler, karboksilik asitler ve diğer bazı substrat sınıfları, faz I reaksiyonlarına gerek duymaksızın direkt olarak gulukuronidasyon reaksiyonlarına (Faz II) girebilirler. Böylece, gulukuronidasyon; ksenobiyotik ajanlar için organizmada ilk detoksifikasyon mekanizması olarak yer alır. Gulukuronidasyon reaksiyonları bir enzim ailesi olan UDP-gulukuronil transferazlarca katalizlenir. Bu enzimler; endüstriyel kimyasalların, ilaçların, karsinojenlerin, besin katkı maddelerinin, pestisitlerin konjugasyonlarını gerçekleştirebilirler ve bu sayede organizmayı, birçok toksik maddenin yarattığı zararlı etkilerinden koruyabilirler. İnsan üretimi kimyasalların çeşitliliğinin sınırsız olması, UDP-gulukuronil transferazlar gibi enzimlerin, farklı formlarının, organizmanın detoksifikasyon sistemindeki önemli rolünü açıkça ortaya koymaktadır. UDP-Gulukuronil transferazların, ksenobiyotik metabolizmasındaki potansiyeli bilindiğine göre bu enzimlerin normal ve hastalık durumlarındaki fonksiyonlarının iyi anlaşılabilmesi için daha fazla araştırma yapmaya ihtiyaç duyulacağı açıktır. UDP-Gulukuronil transferazlar hakkında daha çok bilgiye sahip olabilmek amacıyla, bu çalışmada; UDP-gulukuronil transferazların farklı formlarının saflaştırılması ve immobilizasyonu (yapay detoksifikasyon ünitesi olarakkullanımı) amaçlandı. Bazı saf UDP-gulukuronil transferaz preperasyonlart, ksenobiyotikleri ve endojen bileşikleri substrat olarak kullanabilme yeteneklerine bağlı olarak karakterize edilmişlerdir. Bu enzimlerin substrat spesifiklikleri araştırılarak, steroidler ve safra asitleri için spesifik olan bazı enzim formlarının bağıl olarak kapasitelerenin; naftoller, fenoller v.blerine nazaran daha az etkin oldukları saptanmıştır. Fakat, bu enzim formlarının girişim yapan bir substrat spesifikliğine de sahip olduğu da belirlenmiştir. Bu nedenle, saflaştırma işlemine başlamadan önce UDP-gulukuroniltransferaz enzimlerinin substrat spesifiklikleri test edildi. Daha sonra, lamotrigine ve imipramine UDPGT izoformlarmın saflaştırılması amacıyla, bu substrata karşı en aktif olan tür (guinea domuzu, sıçan, tavşan ve insan) belirlendi. Ayrıca, çözünürleştirme adımı için; enzim formlarının farklı substratlara karşı deterjanla aktivasyonu araştırıldı. Farklı UDPGT formlarının saflaştırılması metodlar üzerinde bazı modifikasyonlar yapılarak öç ayrı tür (sıçan.tavşan, guinea domuzu) kullanılarak gerçekleştirildi. Sıçan karaciğer mikrozomları kullanılarak imipramine-UDPGT 60 kat saflaştırıldı. 1-Naftol ve bilirubin UDPGT sırasıyla yaklaşık 14 ve 70-107 kez, guinea pig mikrozomlarından birlikte; ve bunun yanısıra lamotrigine UDPGT tavşan karaciğerinden saflaştırıldı. ileri aşamada, UDP-gulukuronil transferaz (hepatik mikrozom formunda) chitosan'da tutuklama yöntemiyle immobilize edilerek, immobilize enzimin kimyasal ve fiziksel karakterizasyonu yapıldı. Çalışmanın son aşamasında ise UDP-gulukuronil transferazların detoksifikasyon ünitesi olarak ilaç metabolizma çalışmalarında, medikal kullanımı amacıyla reaktör tasarımı yapıldı. Çalışmalar boyunca elde edilen bulgular doğrultusunda, yapılan yorumlar, sonuçlar ve tartışma kısmında ilgili kısımlarda detaylıca tartışıldı | en_US |
| dc.description.abstract | 158 5 SUMMARY Excretion of xenobiolics from the animal organism generally requires conversion of the xenobiotic to a more water-soluble metabolite. Glucuronidation represents a mojor means of generating water-soluble substances from xenobiotics or endobiotics, which leads to the ultimate excretion of the substances into the urine or the bile. Whereas enzymatic oxidation and reduction reactions have been extensively studied, only recently have we begun to understand the enzymatic processes responsible for the conversion of chemicals to glucuronide conjugates. The conventional view has it that conjugation reactions proceed in the second of a-two-phase sequence oxidation (Phase I), where a substance might be hydroxylated, followed by glucuronidation (Phase II). In fact, this is probably the exception rather than the rule. Many drugs and environmental chemicals (e.g.morphine, naphthols and phenols) already exist in the hydroxylated state when the animal is exposed; amines and carboxylic acids, other classes of substrate for glucuronidation, need not be converted by other metabolic reactions in order to serve as substrates for glucuronide formation. Thus, glucuronidation, as one of many types of conjugation reactions available to the organism, is a first line reaction in the metabolism of xenobiotic agents. The glucuronidation reaction is catalysed by a family of enzymes, the UDP-glucuronyl transferases (UDPGTs), which have evolved discrete specificities in response to the need to eliminate potentially toxic endobiotic and environmentally produced xenobiotic compounds. The fact that many of these enzymes can also conjugate an extremely wide range of man-made drugs, industrial chemicals, carcinogens, food additives and pesticides must be regarded as purely fortuitous, but demonstrates the effectiveness of this enzyme system in the protection of an organism against the harmful (or potentially harmful) effects of such compounds. The seemingly limitless capability of man to produce new chemicals appears to be matched by the ability of detoxication system such as the UDPGTs to deal with them. The complement of UDPGT isoenzymes appears to vary between species, with differences in the substrate specificities of the "same" enzyme existing in different species. As the potential role of these enzymes in xenobiotic metabolism has been known, there is obviously much still to learn about the UDPGTs and their function in health and disease.159 Depending on the physiological importance of these enzymes; in order to understand much more about the behaviour of the UDPGT family; in this work, the purification, of UDPGTs from liver and their use in detoxification system as a medical application, in immobilized form were aimed. Some purified UDPGTs have been characterized with respect to their ability to use xenobiotics and endogenous compounds as substrates. Substrate specificty of several of these enzyme forms specific for steroids or bile acids was relatively narrow, however most enzyme forms have overlapping substrate specificities. So that before starting the purification, substrate specificity of UDPGT was searched. Then for purifiying the lamotrigine and imipramine UDPGT, which form N-glucuronides, the species (guinea pig, rabbit, rat, human) that contain best activity towards lamotrigine and imipramine, and the detergent activation towards different substrates for the solubulization step of purification were searched. The purification of different UDPGT forms were carried out with the modification of the recent methods from three different species (rat, rabbit and guinea pig). By using rat liver microsomes imipramine-UDPGT was purified 60-fold. 1-Naphthol and bilirubin UDPGT was co-purified approximately 14-fold and 70-107 fold, respectively, from guinea pig liver microsomes, and lamotrigine-UDPGT was also purified from rabbit liver microsomes. Furthermore, the UDPGTs (hepatic microsomes) was immobilized by enterappment in Chitosan. The characterization (chemical/physical) of immobilized enzyme via free enzyme was also made, and at last step; in order to maintain a detoxification unit for the medical application of UDPGTs in drug metabolism studies, two reactor design was performed. Comments; advantages and disadvantages of all findings were discussed in detail pertinant to at the end of each section which were given in results and discussion. | en_US |
| dc.identifier.endpage | 169 | en_US |
| dc.identifier.startpage | 1 | en_US |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/11454/83940 | |
| dc.identifier.yoktezid | 24034 | en_US |
| dc.language.iso | en | en_US |
| dc.publisher | Ege Üniversitesi | en_US |
| dc.relation.publicationcategory | Tez | en_US |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/closedAccess | en_US |
| dc.subject | Biyokimya | en_US |
| dc.subject | Biochemistry | en_US |
| dc.subject | Glucuronosyl transferase | en_US |
| dc.subject | Glucuronosyl transferase | en_US |
| dc.subject | Glükuronidaz | en_US |
| dc.subject | Glucuronidase | en_US |
| dc.subject | Saflaştırma | en_US |
| dc.subject | Purification | en_US |
| dc.subject | İmmobilizasyon | en_US |
| dc.subject | Immobilization | en_US |
| dc.title | Isolation, purification and immobilization of UDC-glucuronyl transferace. | en_US |
| dc.type | Doctoral Thesis | en_US |
