Thermus Oshimai DSMZ 12092'ye ait β-galaktosidazın kısmi karakterizasyonu ile transferaz aktivitesinin belirlenmesi ve β-galaktosidaz geninin E. Coli'de klonlanması
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2012
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
β-Galaktosidazlar hidrolitik enzim sınıfına ait olup laktoz hidrolizi amacıyla süt endüstrisinde uzun bir süredir kullanılmaktadır. Laktoz intoleransı, sütün baskın şekeri laktozun yeterli sindirilememesinden kaynaklanmaktadır ve bu sebeple β-galaktosidazlar laktozsuz süt ürünlerinin üretimi amacıyla son derece önemlidir. Termofiliklerden elde edilen termostabil β-galaktosidazlar mezofilik enzimlerle karşılaştırıldığında düşük-laktozlu süt ürünlerinin üretiminde çok önemli avantajlara sahiptir. Enzimin laktoz hidrolizinde kullanılmalarının yanı sıra son zamanlarda transferaz aktivitesi sonucu laktozdan galaktooligasakkaritlerin üretimi açısından oldukça ilgi çekici olmaya başlamıştır. Çalışmamızda Thermus oshimai DSMZ 12092'ye ait β-galaktosidaz enziminin kısmi karakterizasyonuyla beraber transferaz aktivitesi olup olmadığı incelenmiş ve β-galaktosidaz geninin E. coli'de klonlanması gerçekleştirilmiştir. Thermus oshimai DSMZ 12092'nin β-galaktosidaz enziminin hücre içi bir enzim olması sebebiyle öncelikle çalkalamalı erlenlerde ve biyoreaktörlerde pellet üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalkalamalı erlenlerde ve biyoreaktörler bakteriye ait büyüme hızı ve ikilenme süresi belirlenmiş olup sırasıyla 0,29 h-1, 2,41 h ve 0,42 h-1, 1,65 h olarak saptanmıştır. Enzimin kısmi karakterizasyonu amacıyla yapılan çalışmada enzimin çalıştığı optimal sıcaklık ve pH sırasıyla 75 °C ve nötral olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesi üzerine en etkili iki değerlikli katyonun 1,0 mM konsantrasyon kullanıldığında Zn2+ olduğu saptanmış (Zn2+> Fe+2> Ca+2>Cu+2> Mg+2> Mn+2) ve konsantrasyonun artmasına bağlı olarak bu etkinin azaldığı görülmüştür. Ayrıca enzimin bazik pH'lara ve yüksek sıcaklıklara karşı stabilitesinin yüksek olması sebebiyle Thermus oshimai DSMZ 12092'ye ait β- galaktosidaz gen bölgesinin dizisi belirlenmiş olup GenBanka'sına kayıtlanmıştır. Ayrıca β-galaktosidaz geni pBR322 plazmidine klonlanmıştır. β-Galaktosidaz enziminin transferaz aktivitesi ile galaktooligosakkarit (GOS) sentezi HPLC ile kromatografik olarak belirlenmiş ve maksimum GOS üretiminin sağlanması amacıyla farklı reaksiyon (pH, sıcaklık, başlangıç laktoz konsantrasyonu, reaksiyon süresi, enzim konsantrasyonu ve enzim saflığı) koşulları incelenmiştir. En yüksek GOS üretimi 85 °C'de pH 6,0'da, 0,1 U/ml saf enzim ile başlangıç laktoz konsantrasyonu %50 kullanıldığında gerçekleşmiştir.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Thermus oshimai DSMZ 12092, β-galaktosidaz, termostabilite, klonlama, transferaz aktivitesi, galaktooligosakkarit (GOS) sentezi., Thermus oshimai DSMZ 12092, β-galactosidase, termostability, cloning, transferase activity, galactooligosaccarides (GOS) synthesis., Biyomühendislik A.B.D
