İn-vitro kan beyin bariyeri modelinde farklı fraksiyon dozlarında radyasyonun moleküler bariyer geçirgenliğine etkisinin araştırılması

Amaç: Günümüzde beyin kanserleri ve metastazları önde gelen ölüm nedenleri arasında yer almaktadır. Cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi gibi pek çok tedavi yaklaşımına rağmen, bu hastaların sağ kalım sürelerinin uzatılmasında anlamlı başarı elde edilememiştir. Kanserin biyolojik olarak tedavi edilmesinde kullanılan ilaçlardan elde edilen verim kan beyin bariyeri (KBB) nedeniyle terapötik ajanların tümöre ulaşması engellendiğinden çok düşüktür. Amacımız farklı fraksiyon dozlarında radyoterapi ile KBB geçirgenliğindeki geçişin değişimini değerlendirmek ve bu bozulmuş işleyişinden yararlanabilecek tedavi stratejilerine zemin hazırlamaktır. Gereç-Yöntem: İn vitro KBB modeli için gözenekli membran ile ayrılmış insert ve 24 kuyucuklu plakaya hücrelerin ekimi ile yapıldı. Ekim için insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC) ve insan astrosit hücreleri (NHA) kullanıldı. Oluşturulan modelin doğruluğu transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü ile doğrulandı. TEER ölçümü için Fizik bölümü tarafından geliştirilen cihaz kullanıldı. Radyoterapi; tek fraksiyon ,2, 4, 6, 8, 16 ve 25 Gy dozlarda uygulandı. İyonize radyasyon uygulaması sonrası hücreler TEER cihazı ile her iki saatte bir ölçüm alınacak şekilde 72 saatlik inkübasyona alındı. Ayrıca membran geçirgenliğine göre değişebilecek ilaç doz etkinliğinin değerlendirilebilmesi için insertin yerleştirildiği yirmi dört kuyucuklu plakanın zeminine glioblastom (GBM) hücre hatları ekildi. Işınlanan KBB modeline iki farklı ilaç uygulandı. ELISA yöntemi ile membran geçirgenliğinin belirlenmesi, MTT proliferasyon testi ve hücre yara iyileştirme testi kullanıldı. Bulgular: Işınlama sonrası tüm doz gruplarında kontrol grubu ile kıyaslandığında TEER değerlerinde anlamlı düşüş saptandı (p<0.001). Fraksiyon dozları kendi içinde değerlendirildiğinde anlamlı bir fark saptanmadı (p=0.639). Dozdan bağımsız düşüş en belirgin 2.-6. saatler arasında gerçekleşti. Direnç düşüş ivmesindeki değişimin dozla doğru orantılı olarak arttığı kaydedildi. Işınlama sonrası zemine ekilen GBM hücre hatlarının proliferasyonunu değerlendirebilmek için uygulanan temozolomidin (TMZ) GBM hücrelerinin proliferasyonları üzerinde etkili olduğu ve etkin geçiş için en düşük dozun 4 Gy olduğu gözlendi. Repopulasyon ve onarım kapasitesinin göstergesi olarak yapılan hücre yara iyileştirme deneyinde de düşük fraksiyon dozlarında ışınlama sonrası TMZ uygulanan gruplarda erken saatlerde köprüleşme başlarken yüksek fraksiyon dozlarında 72 saatin sonunda yarada kapanma olmadığı görüldü. TMZ’ye kıyasla 750 kat daha büyük olan Trastuzumab (TRAS) uygulaması sonrası yapılan ELISA ölçüm sonuçları değerlendirildiğinde 2, 4 ve 6 Gy uygulanan dozlarda 500 ng/ml altında TRAS düzeyine rastlandı. Sekiz, 16 ve 25 Gy uygulanan dozlarda ise 1500 ng/ml TRAS seviyesi ölçüldü. Sonuç: Çalışmamız, farklı dozlarda iyonize radyasyon ile kemoterapi birleştirildiğinde tedavi edici ajanların tümöre erişimini artırabileceğini ortaya koymakta ve bu ilişkinin zamanla olan bağlantısını değerlendirmektedir. KBB’den geçişin moleküler ağırlıkla ilişkili olduğu, fraksiyon dozundaki artışla orantılı olarak daha büyük maddelerin geçişinin arttırılabileceğini göstermektedir. Çalışmamız; stereotaktik tedaviler, profilaktik beyin ışınlaması ve ilaç kombinasyonlarının birlikte kullanımıyla intrakranial tümörlerin ve metastazların yönetiminde farklı bir bakış açısı gerekliliğini ortaya koymaktadır.

Purpose and Objective: Currently, brain cancers and metastases are among the leading causes of death. Despite many treatment approaches, such as surgery, chemotherapy, and radiotherapy, no significant success has been achieved in prolonging the survival of these patients. The yield obtained from the drugs used in the biological treatment of cancer is very low because the blood-brain barrier (BBB) prevents the therapeutic agents from reaching the tumor. Our aim is to evaluate the changes in the permeability of the BBB with different fraction doses of radiotherapy and to prepare the groundwork for treatment strategies that may benefit from this impaired functioning. Materials/Methods: For the in vitro BBB model, cells were seeded in a 24-well plate with a porous membrane-separated insert. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human astrocyte cells (NHA) were used for seeding. The accuracy of the model was verified by transendothelial electrical resistance (TEER) measurement. For TEER measurement, our own device, which was verified and calibrated in accordance with the literature, was used. Irradiation doses of 2, 4, 6, 8, 16, and 25 Gy were selected for radiation application. After ionizing radiation, the cells were incubated for 72 hours with the TEER device in such a way that measurements were taken every two hours. In addition, glioblastoma (GBM) cell lines were seeded on the bottom of the twenty-four-well plate, where the insert was placed, in order to evaluate the drug dose efficiency, which may vary according to membrane permeability. Two different drugs were applied to the irradiated BBB model. Determination of membrane permeability by ELISA, MTT proliferation assay, and cell wound healing assay were used. Results: There was a significant decrease in TEER values in all dose groups after irradiation compared to the control group (p<0.001). However, no significant difference was found when fraction doses were evaluated within themselves (p = 0.639). The most significant doseindependent decrease occurred between the 2nd and 6th hours. It was noted that the change in resistance decline acceleration increased in direct proportion to the dose. Temozolomide (TMZ), which was applied to evaluate the proliferation of GBM cell lines seeded on the ground after irradiation, was effective on the proliferation of GBM cells, and the lowest dose for effective passage was 4 Gy. In the cell wound healing experiment performed as an indicator of repopulation and repair capacity, it was observed that while bridging started in the early hours in the TMZ-treated groups after irradiation at low fraction doses, there was no wound closure at the end of 72 hours at high fraction doses. When the results of ELISA measurements performed after the administration of Trastuzumab (TRAS), which is 750 times larger than TMZ, were evaluated, TRAS levels below 500 ng/ml were found at doses of 2, 4, and 6 Gy. In doses of 8, 16, and 25 Gy, a TRAS level of 1500 ng/ml was measured. Conclusion: Our study demonstrates that combining different doses of ionizing radiation with chemotherapy may increase the access of therapeutic agents to the tumor and evaluates the relationship with time. In addition, it shows that passage through the BBB is related to molecular weight and that the passage of larger substances can be increased in proportion to the increase in fraction dose. Based on our study, the combination of stereotactic treatments, prophylactic brain irradiation, and drug combinations offers a new perspective in the treatment of intracranial tumors.