Okzalat oksidaz enziminin izolasyonu ve saflaştırılması
Küçük Resim Yok
Tarih
1988
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/closedAccess
Özet
Arpa (Hordeum vulgare) çimlerinin okzalat oksidaz enzimini içerdiği uzun bir süreden beri bilinmektedir. Oksalat oksidaz enzimi, son yıllarda klinik amaçlı uygulamalar için üzerinde yoğun olarak çalışılan okzalat oksidaz enzim elektrotları için temel materyaldir. Bu sebeple okzalat oksidazın uygun bir kaynaktan ekonomik bir biçimde izolasyon ve saflaştırılması büyük bir önem taşımaktadır. Bu çalışmada, arpa çimi köklerinden okzalat oksidaz izole edildi ve elde edilen preparatın karakterizasyonu üzerinde çalışıldı. Arpa tohumlarının on gün süreyle oda koşullarında çimlendirilmesi ile elde edilen çimin kökleri enzim izolasyonu için çıkış materyali olarak kullanıldı. Çeşitli izolasyon ve saflaştırma tekniklerinin incelenmesi, km sabitinin tespiti ve safsızlık yaratan unsurların uzaklaştırılması gibi seri çalışma yapıldı. Söz konusu çalışmalardan elde edilen verilerin değerlendirilmesiyle yüksek bir aktiviteye sahip çözünür oksalat oksidaz preparatı elde edilmiştir. Blender ile kıyılan arpa çimi kökleri soğuk (4 oC) 0,005 M fosfat tamponunda (pH 7,5) homojenize edildi. Birkaç kat tülbent bezinden süzülerek selülozik artıklardan arındırılan homojenizatın içerdiği nişasta partikülleri ve hücre enkazı 3000 rpm- de 30 dakika santrifüjlenerek uzaklaştırıldı. Takibeden işlemede, çözeltide kirlilik yaratan unsurların ön uzaklaştırması amacıyla DEAE-Sephadex kolonundan (4x10 cm) yararlanıldı. Çözelti geçişi tamamlandığı zaman kolon, protein çıkışı sona erene kadar 0,05 M fosfat tamponu (Ph 7,1) ile yıkandı. Yabancı proteinler, eluatın 80 oC'de 3 dakika bekletilmesiyle denatüre edildi. Kısa sürede soğutulan çözelti içinde oluşan çökelekler santrifüjlenerek uzaklaştırıldı. Santrifijattaki proteinler amonyum sülfat doygunluğunda (%70) çöktürüldü. Santrifüjle elde edilen çökelekler belirli bir hacme seyretildikten sonra 0,005 M fosfat tamponuna (pH 7,5) karşı 4 oC'de 30 saat süreyle diyalizlendi. İşlem sonunda, diyaliz torbalarında oluşan çökelek santrifüjlenerek çözeltiden ayrıldı ve çözeltinin daha yüksek bir enzimatik aktiviteye sahip olduğu bulundu. Çözelti DEAE-Sephadex kolonuna transfer edildi ve kolon sırasıyla 0,005 M (pH 7,5) ve 0,05 (pH 7,1) fosfat tamponlarıyla yıkandı. Söz konusu iyon değişim kromatografisi ile ayrılan protein fraksiyonları 280 mm'de absorbansları ölçerek belirlendi. Sonuçta üç ayrı proteim fraksiyonunun varlığı tespit edildi. En yüksek enzimatik aktiviteye sahip fraksiyon suya karşı diyalizlendi. Bu işlemlerin sonunda, çözünür okzalat oksidaz prepratı elde edildi. Sephadex G-200 kolonunda moleküler elek kromotografisi yapıldı ve okzalat oksidazın molekül kütlesi yaklaşık olarak 150000 Dalton bulundu. Daha sonra disk-jel elektroforezi uygulandı ve yine benzer bir sonuç elde edildi. Bu bulgulara ilave olarak, okzalat oksidaz preparatında metiyonin bulunmadığı tesbit edildi. Bu bulgular litaratürle uyumludur. Enzimatik aktivitiye riboflavinin etkisinin incelenmesi ile ilgili denemede, riboflavinin enzimatik aktiviteyi arttırmadığı bulundu.Okzalat oksidazın Michealis sabiti (Km) 4,3x10-4 M olarak bulundu.Bunların yanı sıra farklı arpa türlerinde enzimatik aktivitedeki değişimler araştırıldı. Sonuçta türü belirli arpalar ile çalışmanın daha olumlı sonuçlar verdiği bulundu.
Açıklama
Yardımcı Araştırmacı; Erhan Dinçkaya
Araştırma Projesi -- Ege Üniversitesi, 1988
Araştırma Projesi -- Ege Üniversitesi, 1988
