Klinik örneklerden izole edilen adenovirusların PCR ve DNA dizi analizi yöntemiyle tiplendirilmesi

Adenoviruslar, üst ve alt solunum yolu enfeksiyonları (sırasıyla ÜSYE ve ASYE), konjunktivit, gastroen-terit ve hemorajik sistit gibi çeşitli enfeksiyon hastalıklarının etkeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmada, klinik örneklerden izole edilen adenovirusların polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve DNA dizi analizi yöntemi kullanılarak tiplendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, 01 Ocak 2011-31 Mayıs 2011 tarihleri arasında rutin viroloji laboratuvarımıza gönderilen çeşitli klinik örneklerden (295 nazofarengeal sürüntü, 42 konjunktival sürüntü, 13 dışkı) izole edilen 22 adenovirus (AdV) suşu dahil edilmiştir. Pozitif örnekler(14 nazofarengeal sürüntü, 7 konjunktival sürüntü, 1 dışkı), ASYE (n= 8), ÜSYE (n= 6), konjunktivit (n=7) ve gastroenterit (n= 1) klinik tablolarıyla başvuran sekizi erişkin (dördü erkek; medyan yaş: 32.5 yıl), 14’ü çocuk (yedisi erkek; medyan yaş: 1 yıl) hastaya aittir. Hızlı (shell vial) hücre kültürü yöntemiyle izole edilen ve direkt immünfloresan antikor yöntemiyle tanımlanan AdV pozitif örnekler, hekzon geninin “hipervariable region 1-6”yı hedefleyen PCR ve DNA dizi analizi yöntemiyle tiplendirilmiştir. Viral DNA amplifikasyonu Lu ve Erdman’ın tanımladığı PCR primerleri (Adhex F1, Adhex R1) kullanılarak yapılmış; ilk reaksiyonda dizi analizi için yeterli ürün elde edilmediğinde Adhex F2 ve Adhex R2 primerleri ile “nes-ted” PCR uygulanmıştır. Dizi analizi, amplifikasyon primerleri ve Sequence Reagent Mix-DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing kiti (Amersham Pharmacia Biotech Inc, ABD) kullanılarak ABI PRISM 310 Genetic Analyzer cihazında (Applied Biosystems, ABD) gerçekleştirilmiştir. Elde edilen AdV DNA dizilerinin BLAST analiziyle tiplendirilmesi sonunda, serotip 3, 4 ve 8 olmak üzere üç farklı tip saptanmıştır. Çalışmamızda, biri gastroenterit, altısı ÜSYE ve ASYE olan toplam 7 (%31.8) hastanın AdV tip 3; yedisi kon-junktivit, beşi ÜSYE ve ASYE olan toplam 12 (%54.5) hastanın AdV tip 8; biri ÜSYE ve ikisi ASYE olan 3(%13.7) hastanın ise AdV tip 4 ile enfekte olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, AdV tip 8, konjunktivit ve ÜSYE olan hastalarda, AdV tip 3 ise ASYE olan hastalarda en sık saptanan tipler olmuştur. Adenovirusların moleküler tiplendirmesinde BLAST analizinin en uygun yöntemlerden birisi olduğu düşünülmüştür. Ülkemizde, daha fazla örnek sayısı ile adenovirus enfeksiyonlarında tiplerin belirlenmesine yönelik çalışmaların yapılması, ulusal epidemiyolojik verilerin birikmesi açısından önem taşımaktadır.

Adenoviruses are responsible for a broad spectrum of diseases, including upper and lower respiratory tract infections (URTIs and LRTIs, respectively), conjunctivitis, gastroenteritis, and hemorrhagic cystitis. the aim of this study was to determine the adenovirus (AdV) types isolated from clinical specimens by polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing methods. A total of 22 AdV strains isolated between January 1st 2011 to May 31th 2011, from various samples (295 nasopharyngeal swabs, 42 conjunctival swabs, 13 stool) sent to our routine virology laboratory were included in the study. of the 22 patients whose samples yielded adenovirus positivity, 8 were adult (4 were male; median age: 32.5 years) and 14 (7 were male; median age: 1 year) were children. Those specimens (14 nasopharyngeal swabs, 7 conjunctival swabs, 1 stool) were obtained from patients with URTIs (n= 6), LRTIs (n= 8), conjunctivitis (n= 7) and gastroenteritis (n= 1). For the isolation and identification of adenoviruses, rapid (shell vial) cell culture and direct immunofluorescence antibody methods were used, respectively. Molecular typing of adenoviruses were performed by PCR and sequencing of a partial region (hipervariable region 1-6) of the hexon gene. PCR primers (Adhex F1, Adhex R1) used for DNA amplification were from those described by Lu and Erdman, previously. If insufficient DNA was amplified from the first reaction for sequencing, a nested PCR was performed using Adhex F2 and Adhex R2 primers. Sequencing was performed using the amplification primers and Sequence Reagent Mix-DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc, USA) on ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Obtained adenovirus sequences were typed by BLAST analysis and three AdV types namely type 3, 4, and 8 were identified. in our study, AdV type 3 was detected in a gastroenteritis case and six cases with URTIs and LRTIs (n= 7, 31.8%). AdV type 8 was identified as the cause of conjunctivitis in seven patients and of URTIs and LRTIs in five patients (n= 12, 54.5%). AdV type 4 was found to be associated with URTI in one, and LRTIs in two patients (n= 3; 13.7%). Our data indicated that AdV type 8 was the most prevalent type in patients with conjunctivitis and URTIs, while AdV type 3 was the most prevalent type in patients with LRTI. BLAST analysis was thought to be useful for the molecular typing of adenoviruses. in conclusion, advanced studies with large number of specimens are necessary to achive a reliable, detailed national adenovirus database.