Okzalat oksidaz enziminin izolasyonu ve saflaştırılması
Küçük Resim Yok
Tarih
1988
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
56 5 ÖZET Arpa (Hordeum vulgare) çimlerinin okzalat oksidaz enzimini içer diği uzun bir süreden beri bilinmektedir. Okzalat oksidaz enzimi, son yıllarda klinik amaçlı uygulamalar için üzerinde yoğun olarak çalışılan okzalat oksidaz enzim elektrotları için temel materyaldir. Bu sebeble okzalat oksidazın uygun bir kaynaktan ekonomik bir biçim de izolasyon ve saflaştırılması büyük bir önem taşımaktadır. Bu çalışmada, arpa çimi köklerinden okzalat oksidaz izole edildi ve elde edilen preparatın karakteri zasyonu üzerinde çalışıldı. Arpa tohumlarının on gün süreyle oda koşullarında çimlendirilme- si ile elde edilen çimin kökleri enzim izolasyonu için çıkış ma teryali olarak kullanıldı. Çeşitli izolasyon ve saflaştırma teknik lerinin incelenmesi, Km sabitinin tesbiti ve safsızlık yaratan unsurların uzaklaştırılması gibi bir seri çalışma yapıldı. Söz ko nusu çalışmalardan elde edilen verilerin değerlendirilmesiyle yük sek bir aktiviteye sahip çözünür okzalat oksidaz preparatı elde edilmiştir. Blender ile kıyılan arpa çimi kökleri soğuk ( 4 °C) 0,005 M fosfat tamponunda (pH 7,5) homojenize edildi. Birkaç kat tülbent bezinden süzülerek selülozik artıklardan arındırılan homo- jenizatın içerdiği nişasta partikülleri ve hücre enkazı 3000 rpm- de 30 dakika santrifüj lenerek uzaklaştırıldı. Takibeden işlemde, çözel tide kirlilik yaratan unsurların ön uzaklaştırması amacıyla DEAE - Sephadex kolonundan (4x10 cm) yararlanıldı. Çözelti geçişi tamam landığı zaman; kolon, protein çıkışı sona erene kadar 0,05 M fos fat tamponu (pH 7,1) ile yıkandı. Yabancı proteinler, eluatın 80 °C'de 3 dakika bekletilmesiyle denature edildi. Kısa sürede soğutulan çözelti içinde oluşan çökelekler santrifüj lenerek uzaklaş tırıldı. Santrifüjattaki proteinler amonyum sülfat doygunluğunda (%70) çöktürüldü. Santrifüjle elde edilen çökelekler belirli bir57 - hacme seyreltildikten sonra 0,005 M fosfat tamponuna (pH 7,5) karşı 4 °C'de 30 saat süreyle diyal izlendi. İşlem sonunda, diya liz torbalarında oluşan çökelek santrifüj lenerek çözeltiden ayrıldı ve çözeltinin daha yüksek bir enzimatik aktiviteye sahip olduğu bulundu. Çözelti DEAE-Sephadex kolonuna transfer edildi ve kolon sırasıyla 0,005 M (pH 7,5) ve 0,05 M (pH 7,1) fosfat tamponlarıyla yıkandı. Söz konusu iyon değişim kromatografisi ile ayrılan protein fraksiyonları 280 nm'de absorbansları ölçülerek belirlendi. Sonuçta üç ayrı protein fraksiyonunun varlığı tesbit edildi. En yüksek enzimatik aktiviteye sahip fraksiyon suya karşı diyalizlendi. Bu işlemlerin sonunda, çözünür okzalat oksidaz preparatı elde edildi, Sephadex G-200 kolonunda moleküler elek kromatografisi yapıl dı ve okzalat oksidazın molekül kütlesi yaklaşık olarak 150000 Dalton bulundu. Daha sonra disk-jel elektroforezi uygulandı ve yine benzer bir sonuç elde edildi. Bu bulgulara ilave olarak, okzalat oksidaz preparatında metiyonin bulunmadığı tesbit edildi. Bu bul gular literatürle uyumludur. Enzimatik aktiviteye riboflavinin etkisinin incelenmesi ile ilgili denemede, riboflavinin enzimatik aktiviteyi arttırmadığı bulundu. Okzalat oksidazın Michaelis sabiti (K ) 4,3x10" M olarak bulundu. Bunların yanısıra farklı arpa türlerinde enzimatik aktivite- deki değişimler araştırıldı. Sonuçta türü belirli arpalar ile çalışmanın daha olumlu sonuçlar verdiği bulundu
- 58 - SUMMARY It has been konwn for a long time that barley (Hordeum vulgare) seedlings contain oxalate oxidase. Oxalate oxidase enzyme is a fundamental material for oxalate oxidase enzyme electrodes which have been extensively studied for clinical purpo
- 58 - SUMMARY It has been konwn for a long time that barley (Hordeum vulgare) seedlings contain oxalate oxidase. Oxalate oxidase enzyme is a fundamental material for oxalate oxidase enzyme electrodes which have been extensively studied for clinical purpo
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Kimya, Chemistry
