Küçük hücreli Dışı akciğer kanseri Calu1 hücre serisinde cisplatin direncinde etkili genetik bileşenlerin tüm genom CRISPR/Cas9-tabanlı genetik tarama yöntemiyle belirlenmesi

Yüksek metastatik etkisi ile tanımlanan akciğer kanseri, en sık teşhis edilen kanser türüdür. Sitotoksik kemoterapi, invaziv maligniteyi kontrol etmek için kullanılan başlıca tedavi yöntemidir. Kemoterapideki başarısızlıkların %90’ı, ilaç direncine bağlı kanser hücrelerinin invaziv ve metastatik özellik kazanmalarından kaynaklıdır. Cisplatin ise, akciğer kanseri dahil, birçok kanser türünün tedavisinde yaygın olarak kullanılan platin bazlı bir ajandır. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (KHDAK) standart tedavisinde kullanılan cisplatine karşı olguların ~%60'ının zamanla direnç geliştirdikleri bilinmektedir. Bu yüzden cisplatin direnç mekanizmasının aydınlatılması ve yeni moleküler hedeflerin belirlenmesi gerekmektedir. Bu çalışmada genom çapı CRISPR/Cas9-tabanlı genetik bir tarama yöntemiyle cisplatine duyarlı ve dirençli KHDAK hücre serisi Calu1'in bağımlı olduğu bileşenlerin belirlenmesi ve bu bileşenlerin kanser tedavisinde kullanılabilirliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada, CRISPR/Cas9-tabanlı genetik tarama için 19114 insan genini hedefleyen ve toplam 76441 guide RNA'dan (gRNA) oluşan lentiviral 'Brunello kütüphanesi' kullanıldı. Calu-1 hücreleri doz arttırımı metoduyla cisplatine karşı 6.5 kat dirençli hale getirildikten sonra cisplatine duyarlı ve dirençli Calu1 hücreleri kütüphane ile transfekte edildi. Transfeksiyondan sonra gruplar arasındaki gRNA dağılımının belirlenmesi için yeni nesil dizi analizi(NGS) ile derin sekanslama yaptırıldı. NGS sonuçları biyoinformatik analizlerden geçirilerek her hücre grubunda artan ve azalan gRNA'lar belirlenerek bu gRNA'ların hedefledikleri genler listelendi. Aday genler, dirençli hücrede cisplatin duyarlılığını artırmak için azalan gRNA'ların hedefledikleri genler arasından seçildi. Azalan genlerin hücre döngüsü, protein veya lipid metabolizması, vezikül, protein veya iyon transportu, DNA tamiri, mRNA splicing, gen ekspresyonu, RNA işlenmesi, epigenetik, apoptoz, protein modifikasyonu gibi önemli biyolojik yolaklarda rol oynadıkları belirlendi. Gen skoruna ve akciğer kanserindeki yüksek ekspresyon seviyesine göre dirençli KHDAK hücrelerinde PUF60 ve GRP89A olmak üzere 2 aday gen seçildi. Bu aday genler dirençli Calu-1 hücrelerinde knock-out edildikten sonra hücre canlılığı, sitotoksisite, apoptoz, hücre döngüsü, koloni oluşumu, migrasyon gibi önemli hücresel fonksiyonlar üzerine olan etkileri fonksiyonel testlerle belirlendi. Yapılan fonksiyonel analizler sonucunda PUF60 ve GRP89A knockout CR-Calu-1 hücrelerinde cisplatin dıyarlılığını artırdığı, düşük doz cisplatin tedavisinin apoptozu artırdığı, hücre döngüsünü S evresinde durdurarak mitotik katastrofa neden olduğu, koloni oluşumunu ve migrasyonu engellediği belirlendi. Sonuç olarak bu çalışma ile akciğer kanserinde cisplatin direnci gelişiminden sorumlu genetik faktörler ilk kez belirlenerek PUF60 ve GRP89A genlerinin KHDAK hücrelerinde cisplatin direncinden sorumlu bağımlı bileşenler olduğu ilk defa tespit edildi.

Lung cancer is a common type of cancer and one of the leading causes of cancer-related death. Cytotoxic chemotherapy is the main treatment modality used to control invasive malignancy. 90% of the failures in chemotherapy are cancer cells gaining invasive and metastatic properties due to drug resistance. Cisplatin is a platinum-based agent widely used in the treatment of many types of cancer, including lung cancer. It is known that ~60% of cases against cisplatin used in the standard treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) develop resistance over time. Therefore, it is necessary to elucidate the mechanism of cisplatin resistance and to identify new molecular targets. For this purpose, it is planned to determine the dependent components of the cisplatin-sensitive and resistant NSCLC cell line Calu1 with a genome-wide CRISPR/Cas9-based genetic screening method and to investigate the use of these components in cancer therapy. The study used a lentiviral ’Brunello library’ consisting of a total of 76441 guide RNAs (gRNAs) targeting 19114 human genes for CRISPR/Cas9-based genetic screening. After the Calu-1 cells were rendered 6.5-fold resistant to cisplatin by dose escalation method, cisplatinsensitive and resistant Calu-1 cells were transfected with the library. After transfection, deep sequencing was performed with NGS to determine the distribution of gRNA between groups. NGS results were analyzed by bioinformatics, increasing and decreasing gRNAs in each cell group were determined and the genes targeted by these gRNAs were listed. Candidate genes were selected from among the genes targeted by downregulated gRNAs in the cisplatin resistant cell. It has been determined that they play a role in important biological pathways such as cell cycle, protein or lipid metabolism, vesicle, protein or ion transport, DNA repair, mRNA splicing, gene expression, RNA processing, epigenetics, apoptosis, protein modification of downregulated genes. According to gene score and high expression level in lung cancer, 2 candidate genes, PUF60 and GRP89A, were selected in resistant NSCLC cells. After these candidate genes were knocked out in resistant Calu-1 cells, their effects on important cellular functions such as cell viability, cytotoxicity, apoptosis, cell cycle, and colony formation were determined by functional tests. As a result of functional analyzes, it was determined that cisplatin treatment applied in PUF60 and GRP89A knockout CR-Calu-1 cells increased cisplatin sensitivity and apoptosis, caused mitotic catastrophe by blocking the cell cycle in the S phase, and prevented colony formation and migration. As a result, PUF60 and GRP89A genes were found to be a genetic factor responsible for cisplatin resistance in NSCLC cells. In conclusion, with this study, genetic factors responsible for the development of cisplatin resistance in lung cancer were determined for the first time, and it was determined for the first time that PUF60 and GRP89A genes are dependent components responsible for cisplatin resistance in NSCLC cells.