Metisiline dirençli klinik Staphylococcus aureus kökenlerinde antibiyotik direncinin CRISPR/dCas9 temelli genom düzenlemesi ile baskılanması

Son yıllarda enfeksiyon hastalıklarının tedavisindeki potansiyel terapötik ajanların yetersiz kalması, ilaç endüstrinin yıllar içinde yeni antibiyotik üretimine birçok nedenden dolayı sıcak bakmaması artan direnç sorunuyla mücadelede antimikrobiyal etki için yeni yaklaşımları ve bu yaklaşımlara uygun yeni ilaç arayışlarını başlatmıştır. CRISPR/Cas sistemi, bakteri ve arkelerin plazmid veya faj gibi yabancı DNA'ya karşı geliştirdiği ve yabancı genomu yok etmesini sağlayan RNA temelli nükleaz kompleksidir. Antibiyotik direnciyle mücadelede yeni terapötik arayışı CRISPR/Cas antimikrobiyalleri ile ilgili yapılan araştırmaları hızlandırmıştır. Proje amacımız; CRISPR/Cas9 sistemi ile ciddi bir tehdit olan metisiline dirençli klinik Staphylococcus aureus (Methicillin Resistant S. aureus - MRSA) kökenlerindeki metisilin, gentamisin ve siprofloksasin direnç genlerini hedefleyip, bu genlerin baskılanmasını sağlayarak bakterin direnç profilinde değişiklik gerçekleştirmek ve bakterilerin antibiyotiklere duyarlı hale gelmesini sağlamaktır. Proje kapsamında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim dalı Bakteriyoloji Laboratuvarı'nda izole edilen MALDITOF-MS ile tanımlanması yapılan S. aureus kökenlerinin antibiyotik duyarlılıkları otomatize sistem olan VITEK-2 ile belirlendi. Antibiyotik duyarlılık sonuçlarına göre metisilin direnci gösterdiği belirlenen tüm kökenlerde mecA, grlA, grlB, aacA direnç genlerinin varlığı konvansiyonel PCR ile gösterildi. RW3A primeri ile REP-PCR'da klonal ilişkisi gösterilen kökenlerden seçilen temsilci bir izolatla çalışmaya devam edildi. NCBI veri tabanındaki sekans verileri göz önünde bulundurularak yukarıda belirtilen direnç genlerine yönelik sgRNA'lar tasarlandı. Hedef bölgelere özgü sgRNA'lar kompetan MRSA kökenine elektroporasyon ile aktarıldı. Plazmidi alarak kloramfenikollü TSB'de üreyen kolonilerden seçilen temsilcilerde koloni PCR gerçekleştirildi. Bu kolonilerden total RNA izolasyonu ardından cDNA sentezi gerçekleştirilerek RT-PCR ile mecA, grlA, grlB, aacA genlerinin ekpresyon oranı değişimleri incelendi. Direnç genlerinin baskılanmasına bağlı olarak disk difüzyon ve sıvı mikrodilüsyon ile direnç durumundaki değişimler gösterildi. Knock-out (KO)-mecA ve Wild type (WT) kökenden protein izolasyonu gerçekleştirilerek protein konsanstrasyonu ölçüldü ve PBP2a ekspresyonundaki değişim Western Blot yöntemiyle incelendi. KO kökenlerden genomik DNA izolasyonu gerçekleştirilerek hedef bölgeleri içine alacak şekilde 1000-1200 bp'lik alanlar PCR ile amplifiye edilerek sanger sekans dizi analizi ile konfirme edildi. VITEK-2 sonuçlarına göre 20 klinik S. aureus izolatının hepsi metisiline dirençli olarak bulundu. mecA, grlA, grlB genleri izolatların hepsinde saptanırken üç izolat haricinde aacA geni de izolatlarda konvansiyonel PCR ile gösterildi. RT-PCR sonuçlarına göre WT ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı şekilde mecAKO kökeninde mecA gen ekspresyonunun 1.5 katlık, grlA-KO kökeninde grlA geninin 5.5 katlık, grlB-KO kökeninde grlB geninin 6 katlık, aacA-KO kökeninde aacA geninin 4 katlık azalma gösterdiği belirlendi. Fenotipik antibiyotik duyarlılık testlerindeki sonuçlar değerlendirildiğinde bakterilerdeki mecA, grlA, grlB ve aacA genlerinin baskılanması metisilin, kinolon ve aminoglikozid direncinin kırılmasını sağladı. Sonuç olarak kökenler ilgili antibiyotiklere dirençli kategorisinden duyarlı kategorisine geçti. Western blot ile PBP2a'daki değişim incelendiğinde KO kökeninde WT ile kıyaslandığında PBP2a ekspresyonunda %70 oranında azalma saptandı. Sanger sekans dizi analizine göre grlB ve aacA genlerinde nokta mutasyonları tespit edilirken, grlA ve mecA geninde 3 baz değişiminin gerçekleştiği görüldü. Gerçekleştirdiğimiz çalışma birçok bakteride farklı antibiyotiklere karşı direnci yok etmede CRISPR antimikrobiyallerinin kullanılabileceğini göstermesi açısından önemlidir. Çalışmamız ayrıca CRISPR antimikrobiyalleri ve direnç gelişimi nedeniyle kullanılamayan geleneksel antibiyotiklerin kombine terapide kullanımını inceleyeceğimiz çalışmalara, CRISPR-Cas içeren faj kokteylleri ve bunların nanofarmasötikler ile kombinasyonuna dair ilerleyen süreçteki çalışmalara temel oluşturacak verileri sunmaktadır.;Antibiyotik direnci; Metisiline dirençli Staphylococcus aureus; CRISPR/Cas sistemi.;Drug resistance, microbial; Methicillin Resistant Staphylococcus aureus; CRISPR/Cas system.