Konvansiyonel ve ITS-PCR yöntemleriyle tanısı yapılan Yarrowia lipolytica strainlerinin diğer moleküler biyolojik yöntemlerle tanısının kesinleştirilmesi ve ekstrasellüler enzimlerinin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Küçük Resim Yok
Tarih
2013
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/closedAccess
Özet
Bu tez çalışmasında, daha önceki çalışmalarda çeşitli yöntemlerle tanısı yapılan 22 Yarrowia lipolytica straininin tanısını kesinleştirmek için üç farklı moleküler biyolojik yöntem kullanılmıştır. İlk olarak, ITS1 - 5.8S - ITS2 bölgesi PCR ile çoğaltılarak ve HaeIII, HinfI ve RsaI restriksiyon enzimleri ile kesilerek farklı RFLP profilleri elde edilmiştir. Benzer şekilde, 18S rDNA bölgesi PCR ile çoğaltılıp HaeIII, RsaI ve TaqI restriksiyon enzimleri ile kesilerek farklı RFLP profilleri elde edilmiştir. Hem ITS1 - 5,8S - ITS2 hem de, 18S rDNA bölgelerinin RFLP analizi sonuçları 22 Y. lipolytica strainlerinde birbirleri ile uyumlu olduğu bulunmuştur. Son olarak, 26S rDNA bölgesinin D1/D2 domaini PCR ile çoğaltılmış ve çoğaltılan bölgenin sekans analizi yaptırılmıştır. Sonuç olarak, üç farklı moleküler biyolojik yöntemle bütün Yarrowia lipolytica strainlerinin tanıları kesinleştirilmiştir. Gerçekleştirilen enzim taramaları sonucunda, denenen 22 Yarrowia lipolytica ribonükleaz (RNaz) enzimi üretirken, bu strainlerden sadece 6 tanesi alkalin ekstrasellüler proteaz (AEP) enzimini ürettiği saptanmıştır. Enzim tarama sonuçlarına göre, en yüksek aktivite gösteren birer Yarrowia lipolytica straini seçilmiş ve AEP ve RNaz enzimlerinin üretiminde bu iki Y. lipolytica straini kullanılmıştır. Y. lipolytica TEM YL 5 straininden GPP besiyerinde AEP enzimi üretilmiş ve saflaştırma işlemlerine alınmıştır. Gerçekleştirilen saflaştırma işlemleri sonucunda AEP enzimi, DEAE-selüloz kromatografisi ile % 29,05 verimle 16,46 kat saflaştırılırken Sephadex G-75 kromatografisi ile % 57,76 verimle 4,56 kat saflaştırılmıştır. AEP enziminin karakterizasyon çalışmaları sonucunda, AEP enziminin molekül ağırlığının 30,50 kDa; optimum sıcaklık ve sıcaklık stabilitesinin 30°C; optimum pH ve pH stabilitesinin pH 10,50; N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA peptidini hidrolizleyerek bir kemotripsin tip aktivite gösterdiği; en iyi kazein ve süt tozunu hidrolizlediği; PMSF ile inhibe olarak bir serin proteaz olduğu; aktivitesinin en fazla Mn+2 iyonu ile arttığı; SDS ile aktivitesinin yarısını kaybettiği bulunmuştur. AEP enziminin LC-MS/MS analizi sonucunda veritabanındaki Y. lipolytica alkalin ekstrasellüler proteaz enzimi olduğu doğrulanmıştır. Y. lipolytica TEM YL 21 straininden GPP-sitrat besiyerinde RNaz enzimi üretilmiş ve saflaştırma işlemlerine alınmıştır. Gerçekleştirilen saflaştırma işlemleri sonucunda RNaz enzimi, DEAE-selüloz kromatografisi ile % 37,90 verimle 62,58 kat saflaştırılırken Sephadex G-75 kromatografisi ile % 66,10 verimle 27,23 kat saflaştırılmıştır. RNaz enziminin karakterizasyon çalışmaları sonucunda, RNaz enziminin molekül ağırlığının 40,97 kDa; optimum sıcaklık ve sıcaklık stabilitesinin 30°C; optimum pH ve pH stabilitesinin pH 5,0; poly(A) ribohomonükleotidini en fazla hidrolizleme kapasitesinde olmasından dolayı ribonükleazlarının T2 ailesine mensup olduğu; sodyum azid ile inhibe olduğu; aktivitesinin en fazla Mg+2 iyonu ile arttığı bulunmuştur. RNaz enziminin LC-MS/MS analizi sonucunda veritabanındaki Y. lipolytica T2-benzeri ribonükleaz enzimi olduğu doğrulanmıştır.;Yarrowia lipolytica, ITS-RFLP, 18S-RFLP, 26S rRNA sekans analizi, alkalin ekstrasellüler proteaz, ekstrasellüler ribonükleaz, enzim saflaştırma, enzim karakterizasyon.;Yarrowia lipolytica, ITS-RFLP, 18S-RFLP, 26S rRNA sequence analysis, alkaline extracellular protease, extracellular ribonuclease, enzyme purification, enzyme characterization.
Açıklama
Araştırma Projesi -- Ege Üniversitesi, 2013
