Probiyotik Lactobacillus casei 21/1'nin olası bağışıklık düzenleyici tır domain proteininin tanımlanması, rekombinant üretimi, saflaştırılması ve biyoinformatik analizi
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2019
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Probiyotiklerin hücre bileşenleri veya ürettikleri moleküllerle insan bağışıklık sistemini etkileyebildikleri bilinmektedir. Bağışıklık sistemindeki önemli kontrol noktalarından biri Toll Benzeri Reseptör (TLR) sinyal yolağı ve bu sinyal yolağının en önemli elemanları TIR domain proteinleridir. Bakterilerin de TIR domaini içeren proteinleri üretebildikleri ve hatta patojenlerin, bu sinyal yolağını kendi TIR domain proteinleriyle etkileyebildikleri gösterilmiştir. Bununla birlikte probiyotiklerin de TLR sinyal yolağı üzerine etkileri olduğu bilinmektedir, ancak etki mekanizması açıklanamamıştır. Bu tez çalışmasında, bahsedilen etki mekanizmasının anlaşılmasına yönelik, TLR sinyal yolağı üzerine olası etki gösterebilecek probiyotik kökenli bir TIR domain proteininin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu yapılması hedeflenmiştir. Bu bağlamda, yapılan BLAST aramasıyla probiyotik Lactobacillus casei 21/1 genomunda kodlanan bir TIR domain bölgesi (lctir) bulunmuştur. Genomik DNA'nın eldesiyle lctir; pET151D/TOPO, pETM11-SUMO3GFP ve pGEX-4T2 plazmitlerine klonlanmış ve ilgili protein (LcTIR) farklı füzyon partnerleriyle üretilmiştir. Protein üretim optimizasyonu sonucu en verimli üretim; pGEX-4T2-lctir rekombinant plazmiti ile, Ros(DE3)pLysS hücresinden 37°C'de ve 0.5mM IPTG indüksiyonu ile elde edilmiştir. Çözünürlük testi sonucunda proteinin büyük oranda çözünür olmayan fraksiyonda kaldığı tespit edilmiştir. Ayıca, I-TASSER ve RaptorX ile yapılan LcTIR protein modellerinin, TIR domain karakteristik katlanmasına uygun olduğu ve çoklu dizi hizalamaları ile TIR domainlerle korunmuş bölgelerde yüksek benzerlik taşıdığı gösterilmiştir. Böylece literatürde ilk kez probiyotik kökenli bir TIR domain proteini karakterize edilmiştir. Bu çalışmanın, probiyotik TIR proteinlerinin insandaki bağışıklık sistemi üzerine olan etkileri ile ilgili yapılacak araştırmalara ve yapı çözme çalışmalarına öncü bir basamak olacağı düşünülmektedir.
Probiotics are shown to affect the human immune system by their cell components or molecules. One of the important control points in immune system is the Toll-Like Receptor (TLR) signaling pathway and the most important elements of this signaling pathway are TIR domain proteins. It is known that bacteria can produce TIR domain proteins, and also pathogens can influence this signaling pathway with their TIR domain proteins. Probiotics are also known to have effects on the TLR signaling pathway, yet the mechanism of action has not been elucidated. In this context, the TIR domain region (lctir) was found in the genome of the probiotic Lactobacillus casei 21/1 by BLAST search. The genomic DNA was obtained and then lctir was cloned into plasmids pET151/D-TOPO, pETM11-SUMO3GFP and pGEX-4T2 in order to produce the protein of interest (LcTIR) with different fusion partners. The optimum protein production conditions were found as; pGEX-4T2-lctir recombinant plasmid from Ros(DE3)pLysS cells at 37°C with 0.5mM IPTG induction. As a result of the solubility test, most of the protein was found in the insoluble fraction. LcTIR protein models with I-TASSER and RaptorX showed to that LcTIR possess TIR domain characteristic structure. Multiple sequence alignments also verified that LcTIR possess TIR domain conserved regions. This study is thought to be a pioneering step in structure solving studies and researches investigating the effect of probiotic TIR proteins on human immune system.
Probiotics are shown to affect the human immune system by their cell components or molecules. One of the important control points in immune system is the Toll-Like Receptor (TLR) signaling pathway and the most important elements of this signaling pathway are TIR domain proteins. It is known that bacteria can produce TIR domain proteins, and also pathogens can influence this signaling pathway with their TIR domain proteins. Probiotics are also known to have effects on the TLR signaling pathway, yet the mechanism of action has not been elucidated. In this context, the TIR domain region (lctir) was found in the genome of the probiotic Lactobacillus casei 21/1 by BLAST search. The genomic DNA was obtained and then lctir was cloned into plasmids pET151/D-TOPO, pETM11-SUMO3GFP and pGEX-4T2 in order to produce the protein of interest (LcTIR) with different fusion partners. The optimum protein production conditions were found as; pGEX-4T2-lctir recombinant plasmid from Ros(DE3)pLysS cells at 37°C with 0.5mM IPTG induction. As a result of the solubility test, most of the protein was found in the insoluble fraction. LcTIR protein models with I-TASSER and RaptorX showed to that LcTIR possess TIR domain characteristic structure. Multiple sequence alignments also verified that LcTIR possess TIR domain conserved regions. This study is thought to be a pioneering step in structure solving studies and researches investigating the effect of probiotic TIR proteins on human immune system.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Probiyotik, TLR Sinyal Yolağı, TIR Domain, Rekombinant Protein, E.Coli, Protein Modelleme, Probiotics, TLR Signaling, TIR Domains, Recombinant Protein Production, E.Coli, Protein Modeling
