Mycobacterium tuberculosis bakterisinin rifampine karşı geliştirdiği direnç mutasyonlarının elektrokimyasal DNA biyosensörü ile saptanması
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2008
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Bu çalışmada, biotin–avidin etkileşimine dayalı elektrokimyasal bir genosensör tasarımı yapıldı. Yapılan genosensörün gerçek hasta örneklerine uygulanabildiği gösterildi. Çalışmada geliştirilen genosensör Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tedavi sırasında rifampin (RIF) antibiyotiğine karşı geliştirdiği direnç mutasyonlarının tayinine yönelik olarak tasarlandı. Kullanılan prob diziler, bakterinin RIF’e karşı en sık direnç gösterdiği rpoB geninin 507-533. kodonlarını içeren 81 baz uzunluğundaki “hot-spot” (sıcak) bölge’sine karşılık gelen 5 farklı bölgeden seçildi. Çalışamada tek kullanımlık kalem grafit elektrotlar kullanıldı. 5’ ucunda amino-hekzil işaretli prob diziler elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlandı. Prob dizi ile kaplı elektrotların, biotinli olarak çoğaltılmış ve denatüre edilerek tek iplikli hale getirilmiş PCR ürünü hedef dizi ile hibridizasyona tabi tutulup ExtrAvidin–AF ve 1–NF çözeltilerinde bekletilmesinin ardından oluşan naftolün yükseltgenme sinyalleri değerlendirildi. PCR ürünü hedef dizilerin mutasyon içeren ve içermeyen bölgelerine karşılık gelen prob diziler ile hibridizasyonu sonucu alınan naftol yükseltgenme sinyalleri arasındaki farklılıklar, tasarlanan genosensörün seçimliliğini gösterdi. Mutasyon ayırımının en iyi gözlendiği yıkama zamanı, ExtrAvidin–AF ve 1–NF bağlanma zamanları belirlendi. Alınan yanıtlara göre, mutasyonun bulunduğu prob dizi bölgesinden en düşük, diğer bölgelerden en yüksek sinyalin gözlendiği koşullar tayin edildi. Böylece çalışmanın amacı olan, Mycobacterium tuberculosis’in rifampin antibiyotiğine karşı geliştirdiği direnç mutasyonlarının, hastalardan alınan ve biotin işaretli olarak çoğaltılan PCR örnekleri ile biotin–avidin etkileşiminden yararlanarak tasarlanan elektrokimyasal genosensör ile tayini gerçekleştirildi. Çalışmadaki Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tayini basamağını desteklemek için yüzey plazmon rezonans (SPR) yardımıyla geliştirilen optik genosensör ile de bir çalışma yapıldı. Bu çalışmada ise sentetik prob dizi ile sentetik hedef dizi hibridizasyona tabi tutularak Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tayini gerçekleştirildi. Çalışmada altın sensör yüzeyine tiyol işaretli prob dizi tuturuldu ve prob dizilerin yüzeyde dik konumda kalması için aradaki boşluklar 6–merkapto 1– hekzanol ile dolduruldu. Daha sonra rasgele hedef dizi ve prob dizinin karşılığı olan sentetik hedef dizi ile hibridizasyon gerçekleştirildi. Bağlanma ve yıkama sonrası kırılma indisi değerlerindeki farklılanmalar analizin gerçekleşmesini sağladı. Böylece Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tayini tasarlanan optik genosensör ile gerçekleştirilmiş oldu.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Analitik Kimya A.B.D.
