2022-05-052022-05-052019https://hdl.handle.net/11454/74557Son yıllarda canlılardaki bütün hücreler tarafından salgılanan ekstraselüler veziküllerin (EV) çok önemli gelişimsel ve patolojik roller oynadığı ortaya konmuştur. Tıp ve eczacılık alanında bu veziküllerin genomik ve proteomik analizleri yapılarak hastalıkların oluşumu ve gelişimiyle ilgili önemli bilgiler elde edilmektedir. Ayrıca kanser hücrelerinden salgılanan EV’lerde bulunan özgül proteinler ve nükleik asitler, bu EV’lerin kanser tanısı amacıyla kullanılabilmesini mümkün kılmaktadır. Nanoboyutlu kesecik yapıları sayesinde tedavi amaçlı taşıyıcı sistemler olarak da değerlendirilmektedirler. Bu tür araştırmalarda kullanılabilmeleri için, EV’lerin hücrelerden salgılanan giğer bileşenlerden (serbest proteinler ve nükleik asitler, apoptotik cisimcikler, metabolik ürünler vb.) mümkün olduğunca arınmış olarak izole edilmesi gerekir. EV izolasyonu için kullanılan tüm yöntemlerin kendine özgü yetersiz yanları vardır ve yüksek saflıkta EV eldesi sağlayamamaktadır. Bu nedenle bu projede, hücre kültürü ortamından ekstraselüler veziküllerin diğer hücresel bileşenlerden arınmış olarak izole edilmesi amacıyla jel filtrasyon kromatografi tekniğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle Calu1 hücrelerinin ortamı diyafiltrasyonla konsantre edilmiştir. Bu konsantre kültür ortamı Sepharose CL-4B dolgulu kolonlara yüklenerek elüe edilmiştir. Toplanan fraksiyonlarda protein konsantrasyonu ölçülmüş, SDS-PAGE ile protein yoğunluğu incelenmiş, DLS yöntemiyle partikül boyutu ölçülmüş ve SEM görüntüleme ile morfolojik analizleri gerçekleştirilmiştir. Denenmiş olan iki farklı uzunluktaki kolondan daha uzun olanı EV’leri ayrıştırmada daha etkili olmuştur. Elde edilen fraksiyonların SEM görüntülerine göre EV fraksiyonları tam olarak ayrışmış olmamakla birlikte önce daha büyük keseciklerin ve ardından daha ufak olanların elüe edilebildiği gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre, jel filtrasyon kromatografisi farklı EV türlerinin ayrı olarak elde edilmesi bakımından ultrasantrifüj yöntemine göre daha iyidir. Yöntem, biyolojik sıvılara da uygulanarak hastalık tanısı ve tedavisi gibi bir çok alanda uygulama potansiyeli taşımaktadır.In recent years, it has been shown that extracellular vesicles (EVs) are secreted by all cell types in living organisms and play very important roles in physiological and pathological conditions. In the field of medicine and pharmacy, genomic and proteomics analyzes of these vesicles provide important knowledge about the formation and development of diseases. In addition, specific proteins and nucleic acids present in EVs secreted from cancer cells make it possible to use these EVs for the diagnosis of cancer. Due to their nano-sized vesicular structure, they are being evaluated for therapeutic delivery purpose. In order to be used in such studies, EVs should be isolated from other cellular components (free proteins and nucleic acids, appoptotic bodies, metabolic product etc.) as much as it is possible. All methods used for EV insulation have their own drawbacks, therefore, cannot provide highly pure EV isolates. Therefore, the aim of this project was to evaluate the gel filtration chromatography technique to isolate extracellular vesicles free from other cellular components from the cell culture medium. First, the medium of Calu1 cells is concentrated by diafiltration. This concentrated culture medium was loaded onto Sepharose CL-4B filled columns and eluted. In the collected fractions, protein concentration was measured, protein density was evaluated by SDS-PAGE, particle size was measured by DLS and morphology was evaluated by SEM imaging. The longer one of the tested two different-length columns was more effective in separating the Evs. According to the SEM images of the fractions obtained, it was observed that EV types were not completely separated. However, the larger vesicles eluted first and then smaller ones followed. According to these results, gel filtration chromatography is better than the ultracentrifuge method in order to obtain different EV species separately. The method can also be applied to biological fluids in order to investigate its potential to be applied in disease diagnosis and treatment.trinfo:eu-repo/semantics/openAccessEkstraselüler VeziküllerEksozomlarBoyut Eleme KromatografisiBiyolojik KeseciklerExtracellular VesiclesExosomesSize Exclusion ChromatographyBiological VesiclesProject