Eraç, YaseminGetboğa, Damla2020-12-132020-12-1320192019https://hdl.handle.net/11454/67671Amaç: Çalışmamızın amacı, Huh-7 insan hepatoselüler karsinoma hücre hattında geçici reseptör potansiyel 6 (transient receptor potential canonical 6, TRPC6) kanalının spesifik aktivatörü olan hiperforinin proliferasyon hızı, depo kontrollü kalsiyum girişi (SOCE) ve ilişkili proteinlerin (TRPC1, TRPC6, STIM1 ve Orai1) ekspresyonu üzerine olası etkilerini araştırmaktır. Metot: Bu çalışmada hiperforin inkübasyonunun (24 saat) TRPC1, TRPC6, STIM1 ve Orai1 mRNA ekspresyon düzeyleri üzerine olan etkilerini araştırmak amacıyla gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR, Light Cycler 480, Roche) analizi gerçekleştirildi. Hiperforinin SOCE üzerine etkilerini araştırmak amacıyla Fura-2 ile yüklenmiş Huh-7 hücrelerinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarındaki değişim gerçek zamanlı olarak spektroflurometrede izlendi. Ayrıca hiperforinin Huh-7 hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkileri gerçek zamanlı hücre analiz sistemi (xCELLigence) ile incelendi. Bulgular: qRT-PCR sonuçlarına göre, hiperforin TRPC1 mRNA ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olurken STIM1 ve Orai1 düzeylerinde azalma meydana gelmiştir. Diğer yandan, TRPC6 mRNA ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte belirgin bir artış meydana gelmiştir. Kontrol hücrelerine kıyasla hiperforin ile inkübe edilen (2 saat) Huh-7 hücrelerinde siklopiazonik asitin (CPA) neden olduğu SOCE istatistiksel olarak anlamlı ölçüde artmıştır. Aynı zamanda hiperforin tek başına ya da CPA-aracılı SOCE sonrası uygulandığında hücre içi kalsiyum düzeyinde belirgin bir artışa neden olmuştur. Hiperforinin neden olduğu kalsiyum konsantrasyon artışlarında protein kinaz C’nin rolünü araştırmak amacı ile uygulanan PKC inhibitörü keleritrin varlığında hiperforinin neden olduğu [Ca+2]i artışının belirgin düzeyde azaldığı belirlenmiştir. Hiperforin konsantrasyona bağlı olarak Huh-7 hücrelerinin proliferasyon hızı üzerinde anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. Sonuç: Hiperforinin neden olduğu SOCE artışı, TRPC1 ve TRPC6 mRNA ekspresyon düzeylerindeki artışın bir sonucu olabilir. Hiperforinin Huh-7 hücrelerinde konsantrasyona bağlı olarak proliferasyon hızında neden olduğu azalma hiperforinin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, hiperforin hepatoselüler karsinoma hücrelerinde SOCE’nin aktivasyonu ve düzenlenmesinde önemli bir rol oynuyor olabilir.Objectives: The purpose of our study was to investigate the potential effects of hyperforin which is the specific activator of the transient receptor potential canonical 6 (TRPC6) channel on proliferation rate, store-operated calcium entry (SOCE) and expression of SOCE-related proteins (TRPC1, TRPC6, STIM1 and Orai1) in Huh-7 human hepatocellular carcinoma cell line. Methods: In this study, real-time quantitative PCR (qRT-PCR, Light Cycler 480, Roche) analysis was performed to investigate the effects of hyperforin incubation (24 h) on mRNA expression levels of TRPC1, TRPC6, STIM1 and Orai1. In order to investigate the effects of hyperforin on SOCE, changes in intracellular calcium concentrations in Fura-2-loaded Huh-7 cells were monitored on a spectroflurometer in real time. In addition, the effects of hyperforin on the proliferation of Huh-7 cells were examined using the real-time cell analysis system (xCELLigence). Results: According to qRT-PCR results, hyperforin induced statistically significant increase in TRPC1 mRNA expression levels while STIM1 and Orai1 levels were decreased. On the other hand, although not statistically significant there was a significant increase in TRPC6 mRNA expression levels. CPA-induced SOCE was significantly increased in Huh-7 cells incubated with hyperforin (2 h) compared to control cells. At the same time, hyperforin application as alone or after CPA-mediated SOCE caused an increase in intracellular calcium levels. In order to investigate the role of protein kinase C in calcium concentration increases caused by hyperforin, in the presence of the PKC inhibitor Chelerythrine, hyperforin-induced [Ca+2]i increasing was significantly reduced. Hyperforin caused a significant concentration dependent inhibition in the rate of proliferation of Huh-7 cells. Conclusions: Hyperforin-induced potentiating of SOCE may be result of increases in mRNA expression levels of TRPC1 and TRPC6. Inhibitor effects of hyperforin on Huh-7 cells suggest us that hyperforin may be a potential drug for cancer treatment. Furthermore, hyperforin may play an important role in activation and regulation of SOCE in hepatocellular carcinoma cells.trinfo:eu-repo/semantics/openAccessHepatoselüler KarsinomaHuh-7KalsiyumTRPC1TRPC6Hepatocellular CarcinomaCalciumMaster Thesis