Kaplan Türköz, Burcu2025-05-302025-05-302024https://hdl.handle.net/11454/117465Biyoteknolojik uygulamalar için sayısız rekombinant proteinler üretilmekte olup, bu amaçla birçok farklı ekspresyon sistemleri geliştirilmiştir. Lactococcus lactis, genom özelliklerinin iyi bilinmesi, hücre dışına protein salgılama sistemlerinin iyi çalışması ve özellikle gıdalara doğrudan eklenebilecek proteinlerin üretimi için kullanılabilirliği ile iyi bir ekspresyon sistemi haline gelmiştir. Projenin amacı, sakkarozu parçalayıp prebiyotik fruktoz polimerleri oluşumunu katalizleyen levansukraz enziminin ve kalorisi olmayan ve tatlandırıcı olarak kullanılabilecek bitkisel tatlı protein benzeri proteinlerin üretiminde L.lactis ekspresyon sisteminin kullanılmasıdır. Bu amaçla levansukraz ve bitkisel tatlı protein benzeri proteinleri kodlayan genleri pLEB825 plazmidine PnisA promotörü altına yerleşecek şekilde klonlama ve plazmidleri Lactococcus lactis NZ9000 hücrelerine aktarma çalışmaları yapılmıştır. Bitikisel tatlı protein benzeri seçili iki protein başarıyla klonlanmıştır. Thaumatin benzeri protein için plazmid transformasyon sonrası protein üretimi gerçekleştirilmiş ve saflaştırma protokolü oluşturulmuştur. Ancak daha sonra aynı hücrelerden protein üretimi sağlanamamıştır. Yapılan analizler doğrultusunda plazmidlerin hücrelerden atıldığı görülmüştür. Mabinlin benzeri protein için ise farklı koşullarda indüksiyon denenmiş ancak rekombinant protein üretimi tespit edilememiştir. Levansukraz kodlayan gen bölgesi tüm denemelere rağmen pLEB825 plazmidine klonlanamamıştır. Bu duruma çözım olarak başka bir plazmide klonlama çalışmaları yapılmış ve pNZ8148 plazmidine levansukraz geni başarıyla klonlanmıştır. Bu plazmidi taşıyan NZ9000 hücreleri ile rekombinant levansukraz üretiminin de başarıyla gerçekleştiği gösterilmiştir. Tüm bu çalışmalara parallel olarak plazmid taşıyan rekombinant hücrelerin, düşük şeker içeriği nedeniyle kolay bozulabilen bir atık olan peynir altı suyu içeren farklı ortamlarda üretim olanakları incelenmiş ve PAS ortamında verimli şekilde rekombinant L.lactis hücrelerinin ürediği gösterilmiştir.A wide variety of recombinant proteins are manufactured for use in biotechnology and numerous expression systems are being used to achieve this. Lactococcus lactis has emerged as a promising expression system due to its well-characterized genome, efficient secretion of proteins and suitability for producing proteins that can be directly used in food products. The project aimed to utilize L. lactis for the production of: levansucrase, which breaks down sucrose into beneficial prebiotic fructose polymers, and plant sweet protein-like proteins, which function as calorie-free sweeteners. The research involved cloning the genes encoding into pLEB825 plasmid under a nisin controlled promoter (PnisA) known to enhance protein production. While successful cloning occurred for two plant sweet protein-like genes, challenges arose. Thaumatin-like protein production, initially achieved in L. lactis NZ9000 cells after transformation, was later lost, possibly plasmid was expelled from the cells. Attempts to induce Mabinlin-like protein production under various conditions were unsuccessful. The gene region encoding levansucrase could not be cloned into the pLEB825 plasmid despite all attempts. As a solution to this situation, cloning studies were carried out in another plasmid and the levansucrase gene was successfully cloned into the pNZ8148 plasmid. It has been shown that recombinant levansucrase production was also successfully achieved with NZ9000 cells carrying this plasmid. Furthermore, the project investigated the possibility of using whey, a low-sugar waste product, as a growth medium for L. lactis cells containing the plasmids. This approach successfully supported efficient production of recombinant L. lactis cells. In conclusion, the project demonstrated the potential of L. lactis for levansucrase production and explored methods for plant sweet protein production using this system, highlighting the success with whey as a growth medium.trinfo:eu-repo/semantics/closedAccessBitkisel tatlı proteinlevansukrazLactococcus lactisrekombinant proteinpeynir altı suyu.Sweet plant proteinlevansucrase Lactococcus lactisrecombinant proteinwhey.23099Project