İzzetoğlu, Savaş2024-08-212024-08-212020http://155.223.63.101/tez3/2017fen031.pdfhttps://hdl.handle.net/11454/91788Araştırmacı; Ecem ŞenerAraştırma projesi -- Ege Üniversitesi, 2020Nüklear laminler, tip V ara filament proteinleridir ve nukleusa mekanik destek sağlamakla birlikte, kromatin organizasyonu, gen regülasyonu, DNA hasarı ve onarımı, DNA replikasyonu ve sinyal iletimi gibi pek çok hücresel olayda rol oynarlar. Laminlerin en dikkat çekici özelliği ise mitoz bölünme boyunca geriye dönüşümlü olarak ayrılıp birleşmeleridir. Mitoz bölünmenin profaz safhasında laminlerin fosforillenerek ayrıldığı ve geç telofaz safhasında defosforillenerek birleştiği bilinmektedir. Ancak hücre döngüsü boyunca lamin proteinlerinin fosforilasyon dışında bir modifikasyona uğrayıp uğramadığı bilinmemektedir. Bir post-translasyonel modifikasyon olan glikozilasyon, proteinlerin termodinamik, kinetik ve yapısal özelliklerini değiştirerek proteinlerin çevresiyle olan etkileşimini düzenlemektedir. Özellikle nükleositoplazmik proteinlerde O-GlcNAclasyon ve fosforilasyonun proteinin aynı Ser/Thr amino asitleri için yarışmalı olduğu ve bu iki modifikasyonun tersinir olarak aktivite gösterip proteinlerin inaktif veya aktif duruma geçmelerinde rol oynadığı bilinmektedir. Bu bilgilerden hareketle bu tez çalışmasında bu iki modifikasyonun tersinir olarak veya birlikte işlev göstererek hücre döngüsünde lamin A/C proteininin yapısal organizasyonunu düzenliyor olabileceği hipotezi öne sürülmüştür. Bu hipotez doğrultusunda tezin birinci amacı biyoinformatik araçlar kullanılarak insan lamin A/C proteininin olası O-GlcNAc ve O-GalNAc modifikasyonlarını pozisyon spesifik olarak belirlemek ve 3D glikoprotein yapısını oluşturmaktır. İkinci amacı ise hücre döngüsünün G2/M ve S fazlarında senkronize edilmiş A549 akciğer karsinoma hücrelerinde lamin A/C proteininin glikan birimlerini ve fazlar arasındaki glikan değişikliklerini deneysel olarak belirlemektir. Bu amaçla, insan lamin A/C proteininin olası glikozilasyon pozisyonlarının belirlenebilmesi için yüzey alanı, sekonder yapı, hidropati, yüzey ve sıvı erişilebilirliği analizleri gerçekleştirilmiş ve 3D glikoprotein yapısı oluşturulmuştur. Deneysel çalışmalar kapsamında ise hücrelerin doğru bir şekilde senkronize olduğu belirlendikten sonra lektin blotlama ile proteinin uç monosakkaritleri belirlenmiş ve glikozillenmiş lamin A/C proteininin hücredeki lokalizasyonu altın işaretli antikor ve lektinler kullanılarak TEM'de incelenmiştir. Ek olarak, her iki fazda da lamin A/C proteini immünopresipitasyonla saf olarak elde edilip monosakkarit birimleri Cap-LC-ESI/MS-MS ile analiz edilmiştir. Biyoinformatik analizler sonucunda lamin A/C proteininin Ser392'de O- ?-GlcNAc, Ser395'de O-?-GlcNAc ve Thr505'de O-GalNAc glikozilasyon modifikasyonları gösterdiği belirlenmiştir. Deneysel veriler göz önüne alındığında, G2/M ve S fazlarında senkronize edilmiş akciğer karsinoma hücrelerinde lamin A/C proteininin her iki fazda da O-GlcNAc, O-GalNAc, galaktoz, mannoz, fukoz ve sialik asit taşıdığı belirlenmiştir. Biyoinformatik analizler sonucunda proteinin N-glikozilasyon pozisyonu taşımadığı belirlendiğinden bu şekerlerin varlığı Oglikozilasyon ile ilişkilendirilmiştir. Bu bulgulara dayanarak lamin A/C'nin OGlcNAc modifikasyonu ve kor 1 tip O-glikan yapısı üzerinde Sia, Fuc, Man ve OGalNAc modifikasyonlarını gösteren bir glikoprotein olduğu ortaya konmuştur. TEM çalışmalarıyla ise glikozillenmiş lamin A/C proteininin G2/M fazında nükleoplazmada, S fazında ise nukleus kılıfında ve nükleoplazmada lokalize olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile ilk kez hücre döngüsünün interfaz ve mitoz fazlarında lamin A/C proteininin fosforilasyon dışında bir modifikasyon gösterdiği belirlenmiştir. İnterfaz ve mitoz fazlarının her ikisinde de glikozilasyon modifikasyonunun belirlenmesi, lamin A/C proteininin ayrılıp-yeniden birleşmesinde glikozilasyonun, fosforilasyon ile birlikte bir post-translasyonel kod oluşturarak hücre döngüsünün düzenlenmesinde rol aldığını düşündürmektedir.;Lamin A/C, Glikan, Monosakkarit, A549 Hücreleri, İmmünopresipitasyon, CapLC-ESI/MS-MS, TEM.;Lamin A/C, Glycan, Monosaccharide, A549 Cells, Immunoprecipitation, CapLC-ESI/MS-MS, TEM.trinfo:eu-repo/semantics/openAccessProject