Serotonin reseptörü ve serca genlerinin A7R5 vasküler düz kas hücre kültürlerindeki ayrımsal ekspresyon kalıplarının işlevsel sonuçları

In vitro farmakolojik ve fizyolojik çalısmalarda vasküler düz kas hücre modeli olarak A7r5 (embriyonik sıçan torasik aort düz kas hücre hattı) 10-25. pasajlar arasında sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak, primer hücre kültürlerinden farklı olarak, ölümsüzlestirilen bu hücrelerde gen ekspresyonunda dramatik nicel ve nitel degisiklikler gözlenmektedir. Bu nedenle çalısmamızda yapısal proteinlere oranla oldukça düsük düzeyde olan 5-HT2A ve SERCA2b gen ekspresyonlarını ve bunlarla iliskili olası reseptör-aracılı/ reseptörden bagımsız hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki degisimler belirlenerek laboratuvarımızda kullanılan bu modelin validasyonu amaçlanmıstır. Hücre kültür ortamında erken (pasaj no: 14-16) ve ileri (pasaj no: 23-24) pasajlara ait hücrelerde ekspresyon analizleri ve hücre içi Ca+2 ölçümleri yapılmıstır. A7r5 (ECACC) hücreleri besi ortamı (DMEM/Ham’s F-12) ile kültüre edilmistir. Her iki gruba ait hücrelerden elde edilen total RNA’lardan ters transkriptaz reaksiyonu ile cDNA olusturulmustur. 5-HT ve SERCA2b mRNA düzeyleri kantitatif Real Time PCR ile belirlenmistir. Serotoninin neden oldugu reseptör aracılı hücre içi Ca+2 konsantrasyonundaki artıs ve selektif SERCA inhibitörü siklopiazonik asit (CPA) ile aktive edilen depo-kontrollü Ca+2 girisi (SOCE) Ca+2 belirteci fura- 2/AM yüklenmis hücrelerde yüzeyel spektrofluorometri yöntemi ile gerçek zamanlı olarak belirlenmistir. Kantitatif Real time PCR sonuçlarına göre 5-HT2A mRNA düzeyinde anlamlı bir degisiklik olmazken, SERCA2b geninin ekspresyonu ileri pasajlarda erken pasajlara göre belirgin olarak artmıstır (P<0.01). leri pasaj numaralı hücrelerde 5- HT aracılı hücre içi Ca+2 girisi azalırken (P<0.05), CPA’nın neden oldugu depokontrollü Ca+2 girisine baglı hücre içi Ca+2 düzeyi artmıstır (P<0.01). Kültür ortamında hücrelerde eksprese edilen nadir integral membran proteinlerinden biri olan 5-HT2A reseptörlerinin ileri pasajlarda islevsel degisiklik göstermesi proliferatif sürece katıldıgını gösterebilir. SERCA2b geninin ekspresyonunun artması her ne kadar sarkoplazmik retikuluma Ca+2 girisini artıracak gibi gözükse de depo-kontrollü Ca+2 kanalları aracılı yanıtlardaki artıs depoların doluluk oranının artan pasajlama sırasında saglanamadıgını ya da baska bir mekanizma ile SOCE’nin uyarıldıgını düsündürmektedir. Özetle, ileri pasajlarda dramatiklesen fenotipik farklılasmaya 5-HT2A ve SERCA genlerindeki ekspresyonel/islevsel degisiklikler de katkıda bulunabilir. Bu hücre hattı ancak üyeleri eksprese olan sinyal mekanizmalarını çalısmak için uygun gözükmektedir. Ek olarak, in vitro gen ekspresyonunun kontrolü arastırmalarında 24.’den düsük ve yakın numaralı pasajlardaki hücrelerin kullanılması önerilebilir.