Okzalat oksidaz elektrodu hazırlanması ve fizyolojik sıvılarda okzalat tayininde kullanılması
Küçük Resim Yok
Tarih
1991
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
ÖZET Özellikle hiperokzalüri ve okzalosis gibi okzalat metabolizması hastalıkları, çeşitli fizyolojik sıvılar- daki okzalatın klinik analizini zorunlu kılar. Bazı du rumlarda gıda maddelerinin okzalat içeriğini de tayin etmek gerekmektedir. Bu nedenle, günümüze kadar çeşitli okzalat tayin yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak kimya sal okzalat tayin metodlarının çoğu zor ve zaman alıcı dır. Son yıllarda, daha çok enzimatik okzalat tayin yöntemleri üzerinde çalışılmaktadır. Enzimatik metodlar, kimyasal yöntemlere karşın daha pratiktir, daha az zaman alıcıdır ve daha doğru sonuçlar verir. Fakat enzimler çok pahalı maddelerdir ve rutin analizlerde, kullanılmaları ekonomik değildir. Bu nedenle çeşitli immobilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Günümüzde okzalat oksidaz immobilizasyonu ve immobilize enzimin uygun bir sensörle birleştirilmesiyle okzalat oksidaz elektrodları gelişti rilmektedir. Sonuç olarak pratik, ekonomik ve basit okzalat tayini amaçlanmaktadır. Bu çalışmada okzalat oksidaz (EC 1.2.3.4), arpa (Hordeum vulgare) çimi köklerinden izole edildi. Arpa çimi kökleri soğuk fosfat tamponunda (pH: 7,5; 5 mM) homojenize edildi. Homojenizat tülbent benzinden süzüldü. Filtrat santrifüj lendi (10 dak. 3000 rpm. 'de) ve çökelek atıldı. Yabancı proteinler termal denatürasyonla (3 dak., 80 C'de) çöktürüldü. Çözelti soğutuldu ve santrifüj- lendi (10 dak., 3000 rpm'de). Süpernatantin içerdiği protein fraksiyonu amonyum sülfat (%70 doygunlukta) ile çöktürüldü. Çökelek celitte adsorplandı ve fosfat tamponu (pH: 7.5; 5 mM) ile geri kazanıldı. Okzalat oksidaz çözel tisinin içerdiği renkli pigmentler çözeltinin silikajelkolondan (1,0x25 cm) geçirilmesiyle protein fraksiyonun dan ayrıldı. Kolonu terkeden protein fraksiyonu 280 nm'- deki absorbans ölçümleriyle izlendi. Eluat saf suya karşı soğukta(+4 °C) 48 saat süreyle diyalizlendi. Diyalizden sonra oluşan çökelek santrifüj lenerek uzaklaştırıldı. Supernatant liyofilize edildi. Sonunda, kısmen saflaştı- rılmış okzalat oksidaz preparatı elde edildi. Preparat, ticari okzalat oksidaz preparatlarma benzer özelliklere sahiptir ancak onlardan daha kararlıdır. Okzalat oksidaz preparatı ile jelatin, jelatin-BSA ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodları hazırlandı. Hepsinde temel elektrod olarak YSI çözünmüş oksijen probları kullanıldı. Jelatin tabanlı okzalat ok sidaz elektrodu hazırlanmasında, jelatin ve okzalat oksi daz, glutaraldehid ($2,5 ' luk ; fosfat tamponu içinde (50 mM ; pH: 7,5)) çapraz bağlanarak immobilize edildi. Selüloz asetat tabanlı elektrod için, öncelikle çeşitli selüloz asetat membranlar hazırlandı. En uygun selüloz asetat membran, çözünmüş oksijen probuyla birleştiril dikten sonra membran, sırasıyla seryum IV sülfat (100 mM ; 0,1 N nitrik asitte) ve BSA (10 mg/ml; borat tamponunda (0,1 M; pH: 9,0)) ile muamele edildi. Sonra, BSA çözel tisine sodyum siyanoborhidrür ilave edildi ve prob 2 saat süreyle bu çözelti içinde bekletildi. Fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7.5) çözülmüş olan okzalat oksi daz, selüloz asetat membran üzerine yayıldı. Enzimin kovalent bağlanmasında bif onksiyonel bir reaktif olan glutaraldehitten (%6,25 'lik; fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7,5)) yararlanıldı. Jelatin-BSA tabanlı okzalat oksidaz elektrodunda ise, jelatin, okzalat oksidaz ve BSA birlikte, glutaraldehid (%2, 5' luk; fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7,5)) yardımıyla çapraz bağlanarak immobilize edildi.Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarına ilişkin çeşitli parametreler incelendi. Optimum pH (3,2) optimum sıcaklık (35 O, optimum tampon konsantrasyonu (50 mM) ve uygun tampon sistemi (suksinat) belirlendi. Sonuçta, çalışma tamponu olarak suksinat tamponu (50 mM; pH: 3,2; 1 mM EDTA ve 0,65 mM 8-Hidroksi- kinolin) kullanılmasına karar verildi. Depo kararlılıkları, substrat spesif iklikleri belirlendi. Okzalat oksi daz elektrodlarmın %100'e varan bir substrat spesifikliğine sahip oldukları tesbit edildi. Her iki elektrodun da, 3 aylık bir süre zarfında ve çalışma sınırları göz önüne alındığında, aktivitelerinin %90'mdan fazlasını korudukları belirlendi. Okzalat oksidaz elektrodları ile idrar okzalat dü zeyleri ölçüldü. İdrar okzalatı ölçümlerinde, porsiyon idrarlarla ve ayrıca 24 saatlik idrar örnekleriyle çalışıldı. İdrarın ölçüme hazırlanması için basit ön işlemler geliştirildi. Tüm ölçümler özel olarak geliştirilen termostatik ölçüm hücrelerinde yapıldı. İdrardan gelen ve girişim yapan maddelerin etkilerini önlemek için EDTA (1 mM) ve 8-Hidroksikinolin (0,65 mM), çalışma tam ponu katkı maddesi olarak kullanıldı. Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarıyla alınan idrar okzalatı ölçüm sonuçları karşılaştırıldı. Olumlu sonuçlar bulundu. Hazırlanan enzim elektrodları ile alınan sonuçlar farklı spektrofoto- metrik yöntemlerin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Bu amaçla Sigma Okzalat Tayin Kiti ile, ve modifiye kolon yöntemiyle spektrof otometrik temelli idrar okzalatı ölçümleri yapıldı.Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarıyla alınan idrar okzalatı ölçüm sonuçları karşılaştırıldı. Olumlu sonuçlar bulundu. Hazırlanan enzim elektrodları ile alınan sonuçlar farklı spektro- fotometrik yöntemlerin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Bu amaçla Sigma Okzalat Tayin Kiti ile, ve modifiye kolon yöntemiyle spektrof otometrik temelli idrar okzalatı ölçümleri yapıldı. Sonuç olarak, okzalat oksidaz elektrodları idrar okzalatı tayin yönteminin çok pratik ve ekonomik olduğu ve ayrıca doğru sonuçlar verdiği tesbit edildi. Özel likle jelatin tabanlı okzalat oksidaz elektrodunun daha iyi niteliklere sahip olduğuna karar verildi. Geliştirilen yöntemde, söz konusu enzim elektrodu için, -6 -4 5x10 - 2x10 M konsantrasyon aralığında doğrusal cevap alınabildiği belirlendi
- 199 - SUMMARY Oxalate levels of various phsyological fluids must be necessary to determine in oxalate metabolism diseases especially like hyperoxaluria and oxalosis, in some situations, it may be also necessary to determine content of oxalate in foodstu
- 199 - SUMMARY Oxalate levels of various phsyological fluids must be necessary to determine in oxalate metabolism diseases especially like hyperoxaluria and oxalosis, in some situations, it may be also necessary to determine content of oxalate in foodstu
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Biyokimya, Biochemistry, Oksalat oksidaz, Oxalate oxidase, Oksalatlar, Oxalates
