Eschericihia coli sialiltransferaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve yapı-işlev ilişkileri
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2005
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Hücre yüzeylerinde yer alan sialik asitler tanıma, tutunma, farklılaşma ve immün düzenleme gibi önemli biyolojik olaylarda işlevsel olan şekerlerdir. Prokaryotlarda sialik asit ve metabolizması üzerine yapılan çalışmalar, kapsül senteziyle ilintili gen bölgelerinde odaklanmıştır. E. coli K92?nin kapsüler polisakkariti 8-NeuAc Ü2 ve 9-NeuAcÜ2 bağlarını içerir. Bu çalışmada bilinen glikoziltransferazlar arasında Ü-2,8 ve Ü-2,9 bağlı polimerleri sentezleme yeteneği taşıdığı bilinen tek enzim olan sialitransferazın (ST) sentezinden sorumlu neuS geni, E. coli K92 genomik DNA?sından klonlanmıştır. PCR ürünü olan 1.23 kb büyüklüğündeki parça pUC vektörüne yerleştirilmiş ve protein ekspresyonu E. coli JM109 soyunda gerçekleştirilmiştir. Yaklaşık 47,5 kDa büyüklüğünde bir bandın varlığı yapılan SDS/PAGE analizlerinin bazılarında gözlenmiş ancak anti-ST antikorları sağlanamadığından Western Blot analizi ile doğrulanamamıştır. neuS genini taşıyan plazmit, bu çalışmada gen kaynağı olarak kullanılan E. coli K92 soyunun transforme edilmesinde de kullanılmıştır. Rekombinant soylarda yapılan elektron mikroskobik analizler, rekombinant K92?de ciddi bir yüzey farklılığının oluşmamasına karşın, E. coli JM109-ST hücrelerinde yüzey sialik asitlerinin kalın bir tabaka oluşturdukları görülmüştür. Çalışmanın ikinci aşamasında, bakteriyel ST yapı işlev ilişkilerinin belirlenmesi için 3 farklı yönlendirilmiş mutagenez çalışması yapılmıştır. Bunlardan ikisi başarılı olmuş ve toplam 409 amino asitten oluşan E. coli K92 ST?ında K173N, K175E, P176A ve W185G amino asit değişiklikleri yapılmıştır. Mutagenez çalışmalarının sonuçları, W185G değişikliğinin enzimin polimerizasyon aktivitesini etkilediğine ve K173N, K175E, P176A değişimlerinin gerçekleştirildiği ve olası membran bağlanma bölgelerinden birisinde yer alan KKKP motifinin enzimin hücre zarına bağlanmasında işlevsel olduğuna ve belirtilen mutasyonların bu bağlantıyı bozduğuna işaret etmiştir. Mutant klonlarda yüzey değişikliklerinin ötesinde çeşitli morfolojik farklılıklar saptanmıştır. Bu çalışmaları takiben yapılan sonikasyonla parçalanmış hücrelerde ekspresyon çalışması, protein bantlarının çakıştığını ve C14 işaretli CMP-NANA ile radyoaktif bir çalışmanın gerekliliğini ortaya çıkardı. Bununla beraber Beckman-Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System aleti ile yapılan dizi analizi çalışmaları, hem yaban tipi klon hemde mutant klonlarda gerçekleştirilen yönlendirilmiş mutagenezlerin ve nokta mutasyonun varlığı %100 oranında doğrulanmıştır.;Sialic acid, Sialyltransferases cloning, Site-Direct Mutagenesis, Lectin labeling, Electron microscopy, Escherichia coli, Glycobiology.;Sialik asit, Sialiltransferaz klonlama, Yönlendirilmiş mutagenez, Lektin işaretleme, Elektron mikroskobi, Escherichia coli, Glikobiyoloji.
Açıklama
Araştırma Projesi -- Ege Üniversitesi, 2005
