Nöral hücre hattında reelin glikoproteininin glikan profilinin belirlenmesi
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2019
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Reelin, nöral gelişmede çok önem taşıyan iyi korunmuş bir ekstraselüler glikoproteindir. Reelin proteinindeki bozukluklar ve RELN geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşan nöral hastalıklara ilişkin birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bu hastalıklarda Reelin'in yapısında bulunan glikanların olası rolü hakkında herhangi bir bilgi bulunmadığı gibi, Reelin'in yapısında yer alan glikanlar hakkındaki bilgiler de çok sınırlıdır. Glikoproteinlerin yapısında yer alan farklı glikan birimleri proteinlerin mikroçevresini değiştirerek görevlerini kontrol edebilirler. Böylece, hücrenin neredeyse tüm işlevlerinde doğrudan veya dolaylı olarak görev alırlar. Aynı aminoasit sıralarına sahip iki proteindeki glikozilasyon değişiklikleri proteinin işlevini doğrudan değiştirebildiği için, Reelin glikoproteininin glikan zincirlerinin de molekülün işlevi üzerinde etkili olması yüksek bir olasılıktır. Bu nedenle bu tez çalışmasında; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattından Reelin glikoproteinini ve önemli fragmanlarını izole etmek ve bu izolatların uç glikan profillerini lektin blotlama ile, bu glikanların yapı (monosakkarit) analizlerini ise CapLC-ESI-MS/MS ile belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaçla, SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattı kullanılmıştır. Hücreler uygun koşullar altında kültüre edikten sonra total ve sitoplazmik protein ekstraksiyonları yapılmıştır. Western Blotlama ile hangi bandın/bantların Reelin proteinine ait olduğu belirlenmiştir. Bu bantların taşıdığı uç glikan birimlerini saptamak için SNA, MAA, GNA, PNA ve DSA lektinleri kullanılarak lektin blotlama yapılmıştır. Hücre hattından immün çöktürme tekniği ile, Reelin glikoproteini izole edilmiştir. İzole edilen Reelin fragmanının monosakkarit analizi, CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattının total protein profili SDS-PAGE ile üç farklı lizis tampon (Ripa, NucBuster, IP-lysis) kullanılarak gösterilmiş, her üçünde de çok yakın sonuçlar elde edilmiştir. Reelin, 400, 310, 250 ve 85 kDa ağırlıklarında olmak üzere dört fragman şeklinde elde edilmiştir. Reelin glikoprotein fragmanlarında uç glikan olarak, ?2, 6 ve ?2, 3 bağlı sialik asitler, ?-Galaktoz, ?-Mannoz, ?-GlcNAc saptanmıştır. Bant alan yoğunluğu bakımından en yüksek değer 400 kDa Reelin fragmanındaki ?2, 3 bağlı sialik asit bandında, 601 birim olarak bulunmuştur. Dört Reelin fragmanındaki toplam bant alan değerleri fazladan aza doğru sırasıyla ?2, 3 bağlı sialik asit (1224 birim), ?-Galaktoz (1165 birim), ?2, 6 bağlı sialik asit (764 birim), ?-GlcNAc (672 birim) ve ?-Mannoz (205 birim) şeklindedir. Reelin glikoproteininin saflaştırılması transfeksiyon yapılmamış hücrelerden immün çöktürme tekniği ile gerçekleştirilmiş ve ~250 kDa'luk Reelin fragmanı saf olarak izole edilmiştir. Bu izolatın monosakkarit analizi sonucu, miktarları fazladan aza doğru sırasıyla; N-asetilgalaktozamin, N-asetilglukozamin, galaktoz, glukoz ve mannoz olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, pek çok hastalık, glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkar. Reelin'in bir glikoprotein olduğunun bilinmesine karşın, glikan profiline ilişkin literatür bilgisi çok sınırlıdır. LC-MS/MS gibi yüksek analitik tekniklerle Reelin glikan analizleri, ilk kez gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, Reelin üretimi için transfeksiyon sistemi kullanılmadan doğal formda saflaştırma yapılması, olası glikan değişimlerini engellemesi açısından önemlidir ve literatürde rastlanmamıştır. Belirlediğimiz Reelin fragmanlarından 85 kDa'luk fragman da ilk kez ifade edilmiştir. Yüksek miktarda aminli glikan birimlerinin (GlcNAc ve GalNAc) belirlenmesi, Reelin üzerinde N-glikanların yanı sıra O-glikanların da önemli bir yerinin olabileceğini göstermektedir. Bu sonuçların ve devamında yapılacak çalışmaların, nöropsikiyatrik hastalıkların mekanizmasının daha detaylı anlaşılmasına ve glikobiyoloji bakış açısıyla bu hastalıkların teşhis ve tedavisi için yapılan araştırmalara katkı sağlaması beklenmektedir.;Reelin, Glikan, Monosakkarit, Nöroblastoma, Western blotlama Lektin blotlama, İmmün çöktürme, LC-MS/MS.;Reelin, Glycan, Monosaccharide, Neuroblastoma, Western blotting, Lectin blotting, Imminoprecipitation, LC-MS/MS.
Açıklama
Fen Fakültesi, Biyoloji A.B.D. Araştırma Projesi
Araştırma Projesi elektronik ortamda bulunmaktadır.
Araştırma Projesi elektronik ortamda bulunmaktadır.
