Primer and PCR optimization for metagenomics study of aspen leaf that differs in tannin content, fertilization and damage history
Yükleniyor...
Tarih
2021
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Leaf associated endophytic mycobiome play critical roles in pant defence system. Several factors including the leaf chemistry, host genotypes and abiotic stresses may shape the leaf mycobiome diversity. This thesis research was carried out to understand the complex relationship among host genotypes, N stress, leaf chemistry and plant associated microbes and their role in plant defence against pathogens and insects. This study used Aspen genotypes from a Swedish Aspen common garden focusing six genotypes treated with three different nitrogen fertilizer doses (0 kg/ha-ambient N fertilization, 15 kg/ha-high level of atmospheric N deposition and 150 kg/ha-industrial fertilization doses) in complete randomized block design with four replications. The central part of this study was to prepare the fungal amplicon library preparation from aspen leaf material for Illumina sequencing to identify the endophytic community. We selected the best extraction kits considering the quality and amount of extracted DNA. Through the logical and chronological steps, we optimized the primers, PCR reaction mixtures and PCR set up to achieve satisfactory bands that allow for successful amplicon for sequencing. We also assessed the effect of genotype and nitrogen treatment on various plant phenotypic responses related to plant health and in order to relate these traits to the mycobiome associated with aspen leaves. Nitrogen fertilization showed impact on leaf chemical properties and damage level depending on genotype and treatment varying response variables. Plant height, chlorophyll content, Venturia damage and ITS concentration were affected significantly by N fertilization. Genotypic differences affected the plant height significantly. Genotypic differences strongly affected the leaf condensed tannins conent. Genotype environment interaction affected the Venturia, anthocyanins content index and ITS concentration. Pearson correlation and scatter plot revealed significant correlations between indexes of nitrogen balance with chlorophyll (0.92**), anthocyanins (-0.54***) and flavanols (-0.73**), chlorophyll content with anthocyanin content index (-0.54***), flavanols content index (-0.42***), anthocyanins content with Venturia damage symptoms (0.38***) as well as ITS concentration with plant height (0.28*) and flavanols content index (0.24*). Condensed tannins showed negative correlation with mites' damage, hypersensitive responses, petiole galls and fungal abundance. Principle Component Analysis suggested the nitrogen balance index, chlorophyll content, anthocyanin content index and flavanols content index were major contributors to PC1 and Venturia, height, mite leaf damage index and anthocyanin were major contributors for PC2. It also revealed a high similarity among treatments and genotypes.
Yaprakla ilişkili endofitik mikobiyom, bitki savunma sisteminde önemli roller oynar. Yaprak kimyası, konukçu genotipleri ve abiyotik stresler gibi çeşitli faktörler yaprak mikobiyom çeşitliliğini değiştirmektedir. Bu tez araştırması, konukçu genotipleri, N stresi, yaprak kimyası ve bitki ile ilişkili mikroplar arasındaki karmaşık ilişkiyi ve bunların patojenlere ve böceklere karşı bitki savunmasındaki rollerini anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada,6 farklı İsveç kavağı, üç farklı azotlu gübre dozu (0 kg/ha-ortam N gübrelemesi, 15 kg/ha-yüksek seviyede atmosferik N birikimi ve 150 kg/ha-ticari gübre) ile muamele edilmiştir. Gübreleme uygulamaları dört tekrarlı olarak tesadüf blokları deneme desenine göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın ana hedefi, kavak yaprağındaki endofitikleri tanımlamada Illumina dizilimi için fungal amplikon kütüphanesinin hazırlanmasıdır. Bunun için, ilk aşamada ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi ve miktarı dikkate alınarak en iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenmiştir. Sonraki aşamada, dizileme için başarılı amplikon veren bantlar elde etmek için primerler, PCR reaksiyon karışımları ve PCR döngüleri optimize edilmiştir. Ayrıca, genotip ve nitrojen uygulamasının bitki sağlığı ile ilgili çeşitli bitki fenotipik tepkilerine etkisi ve bu özelliklerin kavak yapraklarındaki mikobiyomla ilişkisi araştırılmıştır. Azotlu gübreleme, genotip ve uygulama dozuna bağlı olarak yaprak kimyasal içeriğine ve hasar düzeyi üzerine etki göstermiştir. Bitki boyu, klorofil içeriği, Venturia hasarı ve ITS konsantrasyonu, N gübrelemesinden önemli ölçüde etkilenmiştir. Genotipik farklılıklar bitki boyunu ve yaprak tanen yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemiştir. Genotip çevre etkileşimi de Venturia, antosiyanin içerik indeksi ve ITS konsantrasyonunu etkilemiştir. Pearson korelasyonuna göre, azot denge indeksi ile klorofil (0.92**), antosiyaninler (-0.54***) ve flavanoller (-0.73**) arasında; klorofil içeriği ile antosiyanin içerik indeksi (-0.54***) ve flavanol içerik indeksi (-0.42***) arasında; antosiyanin içeriği ile Venturia hasar semptomları 0.38***)arasında ve ayrıca ITS konsantrasyonu ile bitki boyu (0.28*) ve flavanol içerik indeksi (0.24*)arasında önemli korelasyonlar belirlenmiştir. Yoğun tanenlerin, akarların hasarı, aşırı duyarlılık tepkileri, yaprak sapı galleri ve fungus yoğunlu ile negatif korelasyon gösterdiği belirlenmiştir. Temel Bileşen Analizine göre, nitrojen dengesi indeksi, klorofil içeriği, antosiyanin içerik indeksi ve flavanol içerik indeksinin PC1'in; Venturia zararı, bitki boyu, akar yaprağı hasar indeksi ve antosiyanin PC2'nin ana bileşenleri olmuştur. Ayrıca uygulamalar ile genotipler arasında yüksek derecede benzerlik görülmüştür.
Yaprakla ilişkili endofitik mikobiyom, bitki savunma sisteminde önemli roller oynar. Yaprak kimyası, konukçu genotipleri ve abiyotik stresler gibi çeşitli faktörler yaprak mikobiyom çeşitliliğini değiştirmektedir. Bu tez araştırması, konukçu genotipleri, N stresi, yaprak kimyası ve bitki ile ilişkili mikroplar arasındaki karmaşık ilişkiyi ve bunların patojenlere ve böceklere karşı bitki savunmasındaki rollerini anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada,6 farklı İsveç kavağı, üç farklı azotlu gübre dozu (0 kg/ha-ortam N gübrelemesi, 15 kg/ha-yüksek seviyede atmosferik N birikimi ve 150 kg/ha-ticari gübre) ile muamele edilmiştir. Gübreleme uygulamaları dört tekrarlı olarak tesadüf blokları deneme desenine göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın ana hedefi, kavak yaprağındaki endofitikleri tanımlamada Illumina dizilimi için fungal amplikon kütüphanesinin hazırlanmasıdır. Bunun için, ilk aşamada ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi ve miktarı dikkate alınarak en iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenmiştir. Sonraki aşamada, dizileme için başarılı amplikon veren bantlar elde etmek için primerler, PCR reaksiyon karışımları ve PCR döngüleri optimize edilmiştir. Ayrıca, genotip ve nitrojen uygulamasının bitki sağlığı ile ilgili çeşitli bitki fenotipik tepkilerine etkisi ve bu özelliklerin kavak yapraklarındaki mikobiyomla ilişkisi araştırılmıştır. Azotlu gübreleme, genotip ve uygulama dozuna bağlı olarak yaprak kimyasal içeriğine ve hasar düzeyi üzerine etki göstermiştir. Bitki boyu, klorofil içeriği, Venturia hasarı ve ITS konsantrasyonu, N gübrelemesinden önemli ölçüde etkilenmiştir. Genotipik farklılıklar bitki boyunu ve yaprak tanen yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemiştir. Genotip çevre etkileşimi de Venturia, antosiyanin içerik indeksi ve ITS konsantrasyonunu etkilemiştir. Pearson korelasyonuna göre, azot denge indeksi ile klorofil (0.92**), antosiyaninler (-0.54***) ve flavanoller (-0.73**) arasında; klorofil içeriği ile antosiyanin içerik indeksi (-0.54***) ve flavanol içerik indeksi (-0.42***) arasında; antosiyanin içeriği ile Venturia hasar semptomları 0.38***)arasında ve ayrıca ITS konsantrasyonu ile bitki boyu (0.28*) ve flavanol içerik indeksi (0.24*)arasında önemli korelasyonlar belirlenmiştir. Yoğun tanenlerin, akarların hasarı, aşırı duyarlılık tepkileri, yaprak sapı galleri ve fungus yoğunlu ile negatif korelasyon gösterdiği belirlenmiştir. Temel Bileşen Analizine göre, nitrojen dengesi indeksi, klorofil içeriği, antosiyanin içerik indeksi ve flavanol içerik indeksinin PC1'in; Venturia zararı, bitki boyu, akar yaprağı hasar indeksi ve antosiyanin PC2'nin ana bileşenleri olmuştur. Ayrıca uygulamalar ile genotipler arasında yüksek derecede benzerlik görülmüştür.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Aspen, Biotic Stress, Fertilization, Genotype, Illumina Sequencing, ITS Amplicon, Metagenomics, PCR and Primer Optimization, Titrek Kavak, Biyotik Stres, Gübreleme, Genotip, İllimuna Dizileme, ITS, Metagenomik, PCR ve Primer Optimizasyonu
