Rekombinant DPP IV enziminin Sf 9 hücreleri kullanılarak biyoreaktörde üretimi ve karakterizasyonu
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2011
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Çalışmamızda eksikliğinde insan vücudunda metabolizmanın normal seyrini etkileyebilecek önemli hastalıkların baş gösterdiği gastrointestinal, nörolojik, endrokrinolojik, immunolojik pek çok işlevi bulunan insan Dipeptidil Peptidaz IV (DPP IV) enzimi Sf9 hücre hattında baculovirus kullanılarak rekombinant olarak üretilmiştir. Rekombinant insan DPP IV enzimi öncelikle Sf9 vektörü olan pFastBac1 plazmidine aktarılmış ve daha sonra DH10Bac hücresi içinde baculoviral DPP IV elde edilmiştir. Sf9 hücrelerinin baculoviral insan DPP IV ile enfeksiyonu sonucunda üretilen DPP IV enzim aktiviteleri karşılaştırılarak transfeksiyon için uygun enfeksiyon katsayısı (MOI) 0,1 ve transfeksiyon zamanı 96 saat olarak belirlenmiştir. Transfeksiyonun 120.saatindeki DPP IV enzim aktivitesi değeri ile aynı saatteki enfekte olmamış Sf9 hücresinin DPP IV enzim aktivitesi değeri arasında 35,2 katlık fark bulunmuştur. Bu enfeksiyon katsayısı kullanılarak yapılan ‘Virüs replikasyonu ve sitopatik etkisinin incelenmesi’ denemesi sonucunda baculovirusun Sf9 hücrelerine litik etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Çalışmalarımızda 0.saatte enfekte olmayan ve enfekte olan Sf9 hücrelerinin büyüklükleri arasında anlamlı bir fark bulunmazken 24.saatten sonra bu iki bağımsız örneklem arasında anlamlı bir farklılık olduğu görülmüştür. Büyük ölçekte üretim çalışmalarımız için yapılan çalkalamalı griftli kültür erlenlerinde Sf9 hücrelerinin spesifik büyüme hızı 0,03 h-1 (0,73 gün-1) ve ikilenme süresi 22,5 h olarak hesaplanmıştır. Bu veriler ile beraber üretim ortamının reolojik özelliklerine dayanarak ölçek büyütme prosesinin parametreleri olan biyoreaktör içine verilen kabarcıkların boyutu, havalandırma hızı, spesifik ölüm hızı, Reynolds sayısı, Güç sayısı hesaplanmıştır. Büyük ölçekteki üretimler 1,5 litre ve 3 litre için gerçekletirilmiş ve üretim boyunca izlediğimiz oksijen tüketimlerinin sırası ile enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 1,5 litrelik biyoreaktörde 1,8x10-10 mgO2/hücre.dk, baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 2,9 x10 -10 mgO2/hücre.dk olarak hesaplanmıştır. Üretimin değeri 0,0133 dk-1 olarak bulunmuştur. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 96’sında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiş ve molekül ağırlığı 76 kDa olarak belirlenmiştir. 3 litrelik üretimde enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 3 litrelik biyoreaktörde spesifik oksijen tüketim hızı 7,27x10-11 mgO2/hücre.dk (3,75 x10 -17 mol/hücre.s) baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 1,12 x10 -10 mgO2/hücre.dk ve üretimin değeri 0,0129 dk-1 olarak hesaplanmıştır. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 90’ında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiştir. Üretim sonunda 1,5 litrelik üretim (3,4 mU/ml.saat) ve 3 litrelik üretim (2,98 mU/ml.saat) verimlilik açısından karşılaştırıldıklarında üretim verimliliklerinin yakın olduğu görülmüştür. Üretimler tamamlandıktan sonra DPP IV proteini iyon değiştirici ve moleküler elek kromatografilerinin optimizasyonları sağlandıktan sonra %24,5 ‘luk bir verim ile 487 kat saflaştırılabilmiştir. Ayrıca moleküler elek kromatografisi sonuçlarına göre denatüre olmamış DPP IV’ün molekül ağılığı yaklaşık 136 kDa (dimer) olarak hesaplanmıştır. Çalışmamız sonucunda elde edilen DPP IV enzim aktivitesi ve verimlilik değerleri Sf 9 hücre hattı kullanılarak büyük ölçekte rekombinant DPP IV üretiminin başarılı bir şekilde yapıldığını göstermektedir.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Rekombinant protein, DPP IV, Sf9, büyük ölçekte üretim., Recombinant protein, DPP IV, Sf9, Scale up production., Biyoteknoloji A.B.D.
