Klinik Enterobacteriaceae izolatlarında fosfomisin direncinin moleküler epidemiyolojisi ve biyolojik özelliklere etkisi

Diğer antibiyotiklerden farklı bir etki mekanizmasına sahip olması dolayısı ile çapraz dirence yol açmaması, gram pozitif ve GSBL-pozitif birçok gram negatif bakteriye karşı etkili olması fosfomisini yeniden gündeme getirmiştir. Çeşitli virülans faktörleri ve artan antibiyotik direnç oranları nedeniyle oluşturdukları enfeksiyonların tedavisi zorlaşan Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae izolatlarına karşı fosfomisin kullanımının artacağı düşünülmektedir. Fosfomisinin kullanım alanının genişlemesinin olası etkilerinin öngörülmesi önem taşımaktadır. Çalışmamızda fosfomisine dirençli ve duyarlı E. coli ile K. pneumoniae kökenlerinin virülans faktörleri arasındaki olası farklılıkların fenotipik ve moleküler açıdan incelenmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi'nde farklı klinik örneklerden izole edilen 78 E. coli ve 34 K. pneumoniae olmak üzere toplam 112 köken çalışmaya dahil edilmiştir. Öncelikle kökenlerin fosfomisin minimum inhibitör konsantrasyonları agar dilüsyon yöntemiyle belirlenmiştir. 78 E. coli kökeninin 13 tanesi (%16,66), 34 K. pneumoniae kökeninin ise 8 tanesi (%23,5) fosfomisine dirençli bulunmuştur. Fosfomisine dirençli bulunan E. coli (13) ve K. pneumoniae (8) kökenlerinde dirençle ilgili olan genlerin (murA, glpT, uhpT, fos) yanısıra, adezyon (fimH, papC, mrkD), kapsül yapısında yer alan polisakkaritler (uge, ycfM, wabG), üropatojenitede rol alan protein (usp) ve siderofor sentezi (entb) gibi çeşitli virülans faktörleriyle ilişkili genler de araştırılmıştır. Ardından seçilen fosfomisine duyarlı 2 E. coli ve 2 K. pneumoniae kökeni artan konsantrasyonlarda fosfomisin içeren besiyerlerine pasajlanarak dirençli hale getirilmiştir. Ardından dirençli ve duyarlı izogenik varyatların virülans genlerini eksprese etme düzeyleri, biyofilm oluşturma kapasiteleri ve üreme hızları karşılaştırılmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) sonucunda fosfomisin dirençli varyantlar ile duyarlı eşleri karşılaştırıldığında, incelenen virülans genlerinden birçoğunda ekspresyon düzeyi açısından anlamlı bir değişim saptanmamıştır. Spektrofotometrik kristal viyole yöntemiyle dirençli ve duyarlı kökenlerin biyofilm oluşturma kapasiteleri karşılaştırılmış olup aralarında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Fosfomisine dirençli ve duyarlı kökenler sıvı besiyeri içinde 10 saat boyunca inkübe edilmiş ve 2 saatte bir tüplerden örnek alınıp 600nm dalga boyunda absorbans ölçülerek üreme hızları karşılaştırılmıştır. İncelenen dört bakteri çiftinden üçünde duyarlı varyantların dirençlilere göre anlamlı bir şekilde hızlı ürediği ancak 1 kökenin duyarlı veIV dirençli varyantları arasında anlamlı bir farklılık olmadığı görülmüştür. Çalışmamızın verileri, fosfomisine dirençli E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinin üreme hızlarında azalma olmakla birlikte, virülans faktörleri açısından önemli bir dezavantajları olmadığına işaret etmekte, fosfomisin kullanımının dikkatle izlenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır.

Fosfomycin has a different mechanism of action from other antibiotics and does not cause cross-resistance. Also its activity against many gram-positive and ESBL-positive gramnegative bacteria makes fosfomycin a point of interest. It is thought that the use of fosfomycin against Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates, will incresae because infections of these microorganisms are difficult to treat due to various virulence factors and increasing antibiotic resistance rates. Therefore it is important to foresee the possible effects of expanding the use of fosfomycin. In our study, we aimed to examine the possible differences between the virulence factors of fosfomycin-resistant and susceptible E. coli and K. pneumoniae strains from a phenotypic and molecular point of view. A total of 112 strains, constitute of 78 E. coli and 34 K. pneumoniae isolated from different clinical specimens at Ege University Medical Faculty Hospital, were included in the study. The minimum inhibitory concentrations of fosfomycin of the strains were determined by agar dilution method. 13 (16.66%) of 78 E. coli strains and 8 (23.5%) of 34 K. pneumoniae strains were found to be resistant to fosfomycin. In the fosfomycin resistant E. coli (13) and K. pneumoniae (8) strains, genes related to resistance (murA, glpT, uhpT, fos), adhesion (fimH, papC, mrkD), polysaccharides in the capsule structure (uge, ycfM, wabG), gene involved in uropathogenicity (usp) and siderophore synthesis (entb) gene have been investigated. Then, fosfomycin-sensitive 2 E. coli and 2 K. pneumoniae strains were made resistant by passaging into media containing increasing concentrations of fosfomycin. Then, expression levels of virulence genes, biofilm forming capacities and growth rates of these resistant and susceptible isogenic variants were compared. There weren't any significant changes between the expression levels of the most of the virulence genes examined when fosfomycin resistant and susceptible isogenic variants were compared by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Biofilm forming capacities of the resistant and susceptible variants were compared with the spectrophotometric crystal violet method and no significant difference was found between them. Fosfomycin resistant and susceptible variants were incubated in broth media for 10 hours, and the growth rates were compared by measuring the absorbance at 600nm wavelength by taking samples from the tubes every 2 hours. In three of the four bacterial variant pairs examined, we observed that the susceptible variants grew significantly faster than the resistant ones but there was no significant difference between the susceptible and resistant variants of one strain. The data of our study indicate thatVI although the growth rates of fosfomycin-resistant E. coli and K. pneumoniae strains are reduced, fosfomycin resistance didn't pose any significant disadvantage in terms of virulence factors. Therefore the use of fosfomycin should be carefully monitored.