Ü-galaktozidaz enziminin üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması
Küçük Resim Yok
Tarih
2011
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/closedAccess
Özet
Three-phase partitioning, TPP, Ü-galactosidase, watermelon, isolation and purification of proteins.;Üçlü-faz sistemi, TPP, Ü-galaktozidaz, karpuz, protein izolasyon ve saflaştırması.;Ü-D-Galaktozidazlar (Ü-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22) do ada oldukça yaygın olarak bulunan hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan çok çeşitli teknikler ile izole edilerek saflaştırılan bu enzimler galaktooligosakkaritler ve polisakkaritlerde bulunan Ü-1,6-galaktoz birimlerini hidrolizlerler. Özellikle şeker endüstrisinde önemli bir potansiyele sahip olan a-galaktozidazlar, kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde, yapı analizlerinde ve medikal alanda oldukça önemli uygulama alanları olan enzimlerdir. Bu çalışmada, karpuzdan (Citrullus vulgaris) izole edilen Ü-D-galaktozidaz enzimi üçlü faz ayırma (Three Phase Partitioning; TPP) sistemi kullanılarak saflaştırıldı. TPP sisteminde organik çözgen olarak t-bütanol ve tuz olarak amonyum sülfat kullanıldı. TPP sistemini optimize etmek ve enzimi iyi bir verimle saflaştırabilmek için sistemi etkileyen temel parametreler (amonyum sülfat doygunluğu, enzim/t-bütanol oranı ve pH) incelendi. Saflaştırılan Ü- galaktozidaz enzimi karakterize edildi. Bu amaçla, enzim aktivitesine ve kararlılığına sıcaklık ve pH'ın etkisi incelenerek kinetik sabitler (Km ve Vmax) belirlendi. Enzimin saflığını belirlemek ve molekül kütlesini tayin etmek için sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDSPAGE) yapıldı. Optimize edilen koşullarda (%50 (w/v) amonyum sülfat doygunluğu, 1:1ham ekstrakt/t-bütanol oranı (v/v) ve pH 5,5) hazırlanan TPP sistemi ile Ü-galaktozidaz enzimi %76.7 aktivite verimi ile 2.67 kat saflaştırıldı. TPP sisteminden elde edilen enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE analizi ile 45 kDa olarak belirlendi. Enzimin optimum sıcaklık ve optimum pH - sı sırasıyla 60°C ve pH 6 olarak belirlendi. Saflaştırılan enzimin, 4-50°C ve pH 4.0-6.5 aralığında oldukça kararlı olduğu belirlendi. Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk diyagramından sırasıyla 0.22 M ve 0.14 U olarak hesaplandı.
Açıklama
Araştırma Projesi -- Ege Üniversitesi, 2011
