Büyük mum güvesi Galleria Mellonella'nın bazı dokularında ve izole edilmiş mitokondriyumlarında yaşlanma sürecinde gangliyositlerin belirlenmesi
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2013
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Bu çalışmada önce CapLC-ESI-MS/MS sisteminde, böcek beyin, kas, ve yağ dokularında gangliosid belirleme yöntemi optimize edilmiştir. Negatif modda kütlesi iki defa parçalanan doku örneklerinde larva beyninde belirlenen m/z 918 iyonunun GD1'e, hareketsiz prepupada m/z 708 iyonunun GT1'e ve ergin dokularda m/z 721 ile m/z 735 değerlerinin de GD3'e ait olduğu tanımlanmıştır. Omurgalı GD3 yapısında, seramide bağlı glukoza bağlanan ikinci şeker galaktozdur. Böcek glikosfingolipidlerinde seramide bağlanan ikinci şekerin mannoz olduğu bildirilmektedir. Kütleleri ve parçalanma iyonları benzer olduğundan, çalışmanın bu düzeyde ikinci şekerin tanımlanması daha sonraya bırakılmıştır. Yöntemin optimizasyonundan sonra Galleria mellonella'nın yaşlanma sürecinde iki sialik asit taşıyan GD3'ün beyin dokularında ve izole edilen mitokondrilerinde (beyin, kas ve yağ dokularından) değişiklikleri belirlenmiştir. Homojenize edilen örneklerden gangliosidler kloroform/metanol/su uygulamalarıyla katı faz ekstraksiyonu yapılarak elde edilmiştir. Kurutulmuş ekstraksiyonu metanol içinde çözülmüş ve süzülmüş örneğinden alınan 0.2 om'lik miktar, CapLC-ESI-MS/MS sisteminde negatif iyon modunda belirlenmiştir. Belirlemelerde N-asetilnöraminik (sialik) asidi tanımlayan m/z 290 parçalanma iyonu aranmıştır. G.mellonella beyin dokusunda GD3'ün ana iyonu m/z 721 dir. Mutlak pik alan değerinin karşılaştırılmasıyla en fazla genç organizma örneği olan larva beyninde bulunmuştur. Bu değer yaşlı organizma örneği olan hareketsiz prepupa beynine göre yaklaşık bir buçuk, ergin beyine göre ise üç kat daha fazladır. İzole edilmiş mitokondri örneklerinde GD3'ün m/z 721 ve m/z 735 olmak üzere iki ana iyonu bulunmuştur. Mitokondrilerde hakim ana iyon m/z 721 dir. Değişiklikleri beyin dokusundan elde edilen değerlere ters bir şekilde genç organizma örneğinde en düşük düzeydedir. Yaşlı organizma örneği hareketsiz prepupa ile ergin mitokondrilerde sırasıyla iki buçuk ve üç buçuk kat artar. m/z 735 ana iyonu en fazla ergin mitokondrilerde bulunmuştur. Birbirine yakın değerlerde olan genç ve yaşlı örneklerden erginde üç buçuk kat daha fazladır. Böcek beyin dokusunda GD3'ün varlığı CCA (Cancer antennarius agglutinin) lektininin bir GD3 modifikasyonu olan 9-O-asetil GD3'ün uçtaki Ü2,8 bağlı sialik asidine seçici olarak bağlamasından faydalanarak, fluoresan optik yöntemle dolaylı olarak desteklenmiştir. CCA'nın fluoresan optik ışımaları gençten yaşlıya doğru azalmaktadır. Yaşlanan böcek beyninde gangliosidlere ek olarak glikoproteinlere bağlanan sialik asit değişikliklerini de belirlemek için fluoresan işaretli MAA (Maackia amurensis agglutinin) ile SNA (Sambucus nigra agglutinin) lektin uygulamaları yapılmıştır. Ü2,3 glikosidik bağı tanıyan MAA ışıması en fazla genç organizma beyninde bulunmaktadır. Yaşlı organizmada ışımalar azalır. Ü2,6 bağını tanıyan SNA'nın ışıması da yine en fazla genç organizma beyninde fakat MAA'dan daha az olmak üzere bulunmuştur. Benzer şekilde yaşlı organizmada azalır. Elde edilen bulgulara göre; seramide bağlı iki hekzos ve arkadan iki sialik asit içeren dört monosakkaritli glikosfingolipid, böceklerde ilk defa tanımlanmaktadır. Yaşlanma sürecinde GD3'ün azalmasıyla bağlı sialik asitler de azalır. Ek olarak, fluoresan işaretli lektin uygulamaları glikoproteinlere bağlı sialik asitlerin de azaldığını göstermektedir. Hücre yaşlanması ve ölümü sürecinde mitokondrilerden yaşlanma ve ölüm moleküllerinin salınmasına neden olan GD3'ün, beyin dokusunda ve ayrıca dokulardan izole edilmiş mitkondrilerde belirlenmiş olması, G.mellonella dokularında gangliosidlerin bulunduğunu göstermektedir.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Gangliosid, sialik asit, Sinir sistemi, izole edilmiş mitokondri, CapLC-ESI-MS/MS, floresans işaretleme, Galleria mellonella, böcek., Ganglioside, sialic acid, nervous system, isolated mitochondria, CapLC-ESI-MS/MS, fluorescent labeling, Galleria mellonella, insect., Biyoloji A.B.D.
