DNAʼda meydana gelen bazı mutasyonların ve hibridizasyonun tayinine yönelik elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımı
Yükleniyor...
Tarih
2006
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
DNA'da meydana gelen bazı mutasyonların ve hibridizasyonun tayinine yönelik elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımı DNAʼnın çift sarmal yapısının keşfinden yarım asır sonra, 21. yüzyılın başlarında bilim dünyası biyolojik araştırmalarda izlenen çok çeşitli yöntemlerle karşı karşıya bulunmaktadır ve araştırmacılar özellikle moleküler biyoloji ve nanoteknoloji alanlarındaki hızlı gelişmelerden etkilenmektedir. Gen teknolojisindeki gelişmelerle birlikte, analitik tayin yöntemlerinin gelişme yönü de yüksek kalitede, gittikçe küçülen boyutlarda ileri teknoloji ürünlerinin moleküler DNA analizleri için geliştirilmesi doğrultusunda ilerlemektedir. Çalışmamızda DNA hibridizasyonunun ve mutasyonlarının tayinine yönelik farklı özelliklere sahip iki elektrokimyasal DNA biyosensörü tasarımı gerçekleştirildi. Moleküler biyoloji alanındaki tüm bu gelişmeler paralelinde, ilk bölümde Hepatit B hastalığı tedavisinde yoğun olarak kullanılan Lamivudin adlı ilacın, bu hastalığın etkeni olan Hepatit B virüs genomunda meydana getirdiği nokta mutasyonlarının tayini yapıldı. Kalem grafit elektrot, sentetik oligonükleotitler, klon ürünleri ve polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilen ürünler ile yapılan tayinlerde diferansiyel puls voltametri tekniği kullanıldı. Biyosensör tasarımında çeşitli deneysel parametrelerin (hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi, hibridizasyon sonrası sensör yüzeyinin yıkanma süresi, sensör seçimliliği, en düşük tayin sınırı ve tekrarlanabilirlik) tayine olan etkileri incelendi. Asetat tamponu (pH: 4,8) içerisinde gerçekleştirilen ölçümlerde, elektrot yüzeyinden hibridizasyondan önce yanıt alınmazken, hedef dizi ile hibritleşme sonrasında elde edilen yanıtın (guanin yükseltgenme sinyali) yüksek olduğu gözlenmiştir. Prob dizinin hedeften tek bazı farklı ve rastgele dizilerle olan hibridizasyonu ile elde edilen yanıtların ise sırasıyla azaldığı gözlenmiştir. Hassas şekilde hasta örneklerinde de mutasyon tayini gerçekleştirilmiştir. Kalem elektrot yüzeyinin kolayca yenilenebilir olması, kalem elektrot sisteminin çoklu analizlere uygulanabileceği hatta mikroçip cihaz üretiminde kullanılabileceği fikrini düşündürmüştür. Lamuvidinʼin uzun süreli kullanımında virüs genomunda oluşan nokta mutasyonları, virüsün ilaca karşı direnç geliştirmesine neden olduğundan mutasyon tayininin tedaviye yeni bir yön verilmesi açısından önemi büyüktür. Tasarımı yapılan biyosensörle kısa sürede yapılan mutasyon tayini, klasik tayin yöntemlerine farklı bir alternatif getirmiştir. Bu yeni biyosensör yalnızca hızlı, ucuz ve kolay analiz sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda iki ayrı türdeki lamivudin direnç mutasyonu hakkında bilgi vermektedir. Çalışmamızın ikinci bölümünde gıda kaynaklı hastalıklara neden olan Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis bakterisinin tayinine yönelik biyosensör tasarımı yapılmıştır. Salmonella bakterisini tanımlayan DNA parçasının (Salmonella genomunun) tayini, enzime dayalı genosensör ile gerçekleştirilmiştir. Hibridizasyon tayini, biotin-streptavidin etkileşiminin kullanıldığı, sandviç modelli hibridizasyon tekniğiyle spesifik olarak oluşan ürün “α-naftol” üzerinden yapılmıştır. Diferansiyel puls ve kare dalga voltametri tekniklerinin kullanıldığı ölçümlerde, tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrot yüzeyinde gerçekleşen ikili hibrit yapısı (sandviç hibrit) en yüksek yanıtı vermiştir. Hedef dizi yerine rastgele dizi kullanıldığında ise yanıtta büyük bir azalma olmuştur. Çeşitli özellikte probların hibridizasyona etkisi, prob tutturma metodu, hedef konsantrasyonu, polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilen ürünlerin seyrelme oranı gibi deneysel parametreler incelendi. Ayrıca en düşük tayin sınırı ve bağıl standart sapma gibi parametreler de hesaplandı. Bu elektrokimyasal genosensörle 50 kez seyreltilmiş PCR ürünleriyle bile hedefe özgül olarak hibridizasyon tayini yapılabileceği bulundu. Geliştirilen bu biyosensörle kısa sürede yapılan bakteri tayini klasik tayin yöntemlerine yeni bir alternatif getirmiştir. Tasarımı yapılan her iki biyosensörün de ileride DNA çiplerinde kullanılabilecek teknolojik altyapıyı içerdiği bulundu.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Analitik Kimya A.B.D.
