Serotonin reseptörü ve serca genlerinin A7r5 vasküler düz kas hücre kültürlerindeki ayrımsal ekspresyon kalıplarının işlevsel sonuçları

A7r5, 5-HT2A, SERCA2b.;A7r5, 5-HT2A, SERCA2b.;In vitro farmakolojik ve fizyolojik çalısmalarda vasküler düz kas hücre modeli olarak A7r5 (embriyonik sıçan torasik aort düz kas hücre hattı) 10.-25. pasajlar arasında sıklıkla kullanılmaktadır. Taze dokudan enzimatik yöntemle elde edilen primer hücre kültürlerinden farklı olarak, ölümsüzlestirilen bu hücrelerde gen ekspresyonunda nicel ve nitel dramatik değisiklikler gözlenmektedir. Bu nedenle çalısmamızda yapısal proteinlere oranla oldukça düsük düzeyde olan SERCA2b ve 5-HT2A gen ekspresyonları ve bunlarla iliskili olası reseptör-aracılı veya reseptörden bağımsız hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki değisimler belirlenerek, laboratuvarımızda kullanılan bu hücre hattının geçerliliğinin arastırılması amaçlanmıstır. Bu amaçla, erken (P#14-16) ve ileri (P#23- 24) olarak adlandırdığımız pasajlara ait hücrelerde hedef gen ekspresyon analizleri ve hücre içi Ca+2 ([Ca+2]i) ölçümleri yapılmıstır. A7r5 hücreleri DMEM/Ham's F-12 ile kültüre edilmistir. SERCA2b ve 5-HT2A mRNA düzeyleri gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR) ile belirlenmistir. Serotoninin neden olduğu reseptör-aracılı [Ca+2]i ve seçici sarko(endo)plazmik retikulum Ca+2-ATPaz (SERCA) inhibitörü siklopiazonik asit (CPA) ile aktive edilen depo-kontrollü Ca+2 girisi (SOCE) Ca+2 belirteci fura-2/AM yüklenmis hücrelerde yüzeyel spektrofluorometri yöntemi ile gerçek zamanlı olarak belirlenmistir. 5-HT2A mRNA düzeyinde anlamlı bir değisiklik olmazken, SERCA2b geninin ekspresyonu ileri pasajlarda erken pasajlara göre belirgin olarak artmıstır (P<0,01). ?leri pasaj numaralı hücrelerde 5-HT aracılı [Ca+2]i azalırken (P<0,05), CPA'nın neden olduğu SOCE'ye bağlı [Ca+2]i artmıstır (P<0,01). Kültür ortamında hücrelerde düsük oranda ifade edilen integral membran proteinlerinden biri olan 5-HT2A reseptörlerinin ileri pasajlarda islevsel değisiklik göstermesi bu reseptörün proliferatif sürece katıldığını düsündürmüstür. SERCA2b geninin ekspresyonunun artması her ne kadar SR Ca+2 girisini artırması beklense de SOCE yanıtlardaki artıs, ilerleyen pasajlama sırasında depoların doluluk oranının sağlanamadığını ya da baska bir mekanizma ile SOCE'nin uyarıldığını düsündürmektedir. Özetle, ileri pasajlarda belirginlesen fenotipik farklılasmaya 5-HT2A ve SERCA genlerindeki ekspresyonel/islevsel değisiklikler de katkıda bulunuyor olabilir. Bu nedenle, in vitro gen ekspresyonunun kontrolü arastırmalarında 24.'den düsük ve yakın numaralı pasajlardaki hücrelerin kullanılması daha akılcı gözükmektedir.