Development of chromatographic and electrochemical methods for trastuzumab determination
Yükleniyor...
Dosyalar
Tarih
2019
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Today, the use of monoclonal antibodies in the treatment of a variety of diseases has made them a pioneering product in the biopharmaceutical market. In present thesis, analytical methods for bioequivalence studies of Trastuzumab, which is a monoclonal antibody in IgG structure, affects human epidermal growth factor, and used in breast cancer treatment are examined. For this purpose, three different methods were used. Initial studies included Trastuzumab analysis using HPLC-FLD system in serum samples. For total Trastuzumab determination, purification was performed from serum using a Protein G column and was analyzed by HPLC-FLD system. In the second part, considering the mechanism of action of Trastuzumab, it is examined by using electroanalytical methods whether Trastuzumab analysis can be performed by means of HER2 immobilized electrode surfaces. For this purpose, bare PGE, graphene oxide and multi-walled carbon nanotubes and their gold nanoparticle electrodes were used. After each modification, CV and EIS measurements were taken. The third part includes LC-MS/MS analysis of Trastuzumab on selected peptides after tryptic digestion. The m/z 543.2929 for the IYPTNGYTR signature peptide and m/z 402.3566 for the PTNGYTR fragment were selected and analyzed by the LC-Q-TOF-MS system. In HPLC-FLD studies, although the linearity was excellent (R=0.999) in the 5.0-120 µg/mL range, peak resolution was not sufficient. Furthermore, the selectivity of the method is limited due to multiple peak formation and poor resolution. Compared to other analytical methods, the working time is long and time consuming. When electroanalytical methods were evaluated, the best bonding was obtained with multi-walled carbon nanotubes according to the ΔRct values calculated according to the obtained data. This technique provides a great advantage to get immediate results compared to other methods. In addition, it has been found that the determination of Trastuzumab can be done by using HER2-Trastuzumab interaction for the first time electrochemically. In the LC-MS/MS studies, it was found that the quantitative analysis of Trastuzumab was possible using the LC-Q-TOF-MS system on the selected peptide.
Günümüzde monoklonal antikorların çok çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılması, onları biyofarmasötik pazarında öncü bir ürün haline getirmiştir. Bu tez kapsamında IgG yapısında bir monoklonal antikor olan, insan epidermal büyüme faktörüne etki eden ve meme kanseri tedavisinde kullanılan Trastuzumab'ın biyoeşdeğerlik çalışmaları için analitik yöntemler incelenmiştir. Bu amaçla üç farklı yöntemden yararlanılmıştır. İlk çalışmalar, serum örneklerinde HPLC-FLD sistemi kullanılarak Trastuzumab analizini içermektedir. Toplam Trastuzumab tayini için Protein G kolan kullanılarak serumdan saflaştırma yapılmış ve HPLC-FLD sistemi ile analizlenmiştir. İkinci bölümde Trastuzumab'ın etki mekanizması dikkate alınarak HER2 immobilize edilen elektrot yüzeyleri vasıtasıyla Trastuzumab analizi yapılıp yapılamayacağı elektroanalitik yöntemler kullanılarak incelenmiştir. Bu amaçla yalın PGE, grafen oksit ve çok duvarlı karbon nanotüpler ve bunların altın nanopartiküllü elektrotları kullanılmıştır. Her modifikasyon işleminden sonra CV ve EIS ölçümleri alınmıştır. Üçüncü kısım ise, Trastuzumab'ın triptik bozundurma işlemi sonrasında seçilen peptitleri üzerinden LC-MS/MS analizini içermektedir. IYPTNGYTR işaretli peptidi için m/z 543.2929 ve PTNGYTR fragmenti için m/z 402.3566 iyonu seçilerek LC-Q-TOF-MS sistemi ile analizlenmiştir. HPLC-FLD çalışmalarında, doğrusallık 5.0-120 µg/mL aralığında mükemmel (R=0.999) olmasına rağmen, pik ayrımı yeterli değildir. Ayrıca yöntemin seçiciliği, çoklu tepe oluşumu ve zayıf çözünürlük nedeniyle sınırlıdır. Diğer analitik yöntemlere göre çalışma süresi uzun ve zaman alıcıdır. Elektroanalitik yöntemler değerlendirildiğinde elde edilen veriler doğrultusunda hesaplanan ΔRct değerlerine göre en iyi bağlanma çok duvarlı karbon nanotüpler ile elde edilmiştir. Bu teknik diğer yöntemlere göre anında sonuç almak için büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ayrıca elektrokimyasal olarak ilk defa HER2-Trastuzumab etkileşimi kullanılarak Trastuzumab tayininin yapılabileceği görülmüştür. LC-MS/MS çalışmalarında, seçilen peptit üzerinden LC-Q-TOF-MS sistemi kullanılarak Trastuzumab'ın kantitatif analizinin mümkün olduğu bulunmuştur.
Günümüzde monoklonal antikorların çok çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılması, onları biyofarmasötik pazarında öncü bir ürün haline getirmiştir. Bu tez kapsamında IgG yapısında bir monoklonal antikor olan, insan epidermal büyüme faktörüne etki eden ve meme kanseri tedavisinde kullanılan Trastuzumab'ın biyoeşdeğerlik çalışmaları için analitik yöntemler incelenmiştir. Bu amaçla üç farklı yöntemden yararlanılmıştır. İlk çalışmalar, serum örneklerinde HPLC-FLD sistemi kullanılarak Trastuzumab analizini içermektedir. Toplam Trastuzumab tayini için Protein G kolan kullanılarak serumdan saflaştırma yapılmış ve HPLC-FLD sistemi ile analizlenmiştir. İkinci bölümde Trastuzumab'ın etki mekanizması dikkate alınarak HER2 immobilize edilen elektrot yüzeyleri vasıtasıyla Trastuzumab analizi yapılıp yapılamayacağı elektroanalitik yöntemler kullanılarak incelenmiştir. Bu amaçla yalın PGE, grafen oksit ve çok duvarlı karbon nanotüpler ve bunların altın nanopartiküllü elektrotları kullanılmıştır. Her modifikasyon işleminden sonra CV ve EIS ölçümleri alınmıştır. Üçüncü kısım ise, Trastuzumab'ın triptik bozundurma işlemi sonrasında seçilen peptitleri üzerinden LC-MS/MS analizini içermektedir. IYPTNGYTR işaretli peptidi için m/z 543.2929 ve PTNGYTR fragmenti için m/z 402.3566 iyonu seçilerek LC-Q-TOF-MS sistemi ile analizlenmiştir. HPLC-FLD çalışmalarında, doğrusallık 5.0-120 µg/mL aralığında mükemmel (R=0.999) olmasına rağmen, pik ayrımı yeterli değildir. Ayrıca yöntemin seçiciliği, çoklu tepe oluşumu ve zayıf çözünürlük nedeniyle sınırlıdır. Diğer analitik yöntemlere göre çalışma süresi uzun ve zaman alıcıdır. Elektroanalitik yöntemler değerlendirildiğinde elde edilen veriler doğrultusunda hesaplanan ΔRct değerlerine göre en iyi bağlanma çok duvarlı karbon nanotüpler ile elde edilmiştir. Bu teknik diğer yöntemlere göre anında sonuç almak için büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ayrıca elektrokimyasal olarak ilk defa HER2-Trastuzumab etkileşimi kullanılarak Trastuzumab tayininin yapılabileceği görülmüştür. LC-MS/MS çalışmalarında, seçilen peptit üzerinden LC-Q-TOF-MS sistemi kullanılarak Trastuzumab'ın kantitatif analizinin mümkün olduğu bulunmuştur.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Monoclonal Antibody (mAbs), Trastuzumab, HPLC-FLD, Electrochemical Impedance Spectroscopy, LC-Q-TOF-MS, Monoklonal Antikor (mAbs), Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi
